ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 Duplex Welded tube ለኬሚካል ኢንደስትሪ ኬሚካላዊ አካል የ SPECC1L እጥረት የተቆራረጡ መገጣጠሚያዎች መረጋጋት እና የራስ ቅል ነርቭ ክራስት ሴሎችን ማፍሰስን ይቀንሳል።

Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ ያለው የአሳሽ ስሪት እየተጠቀሙ ነው።ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)።በተጨማሪም, ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ, ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን.

ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 Duplex Welded tube ለኬሚካል ኢንዱስትሪ

ሊያኦቼንግ ሲሄ ኤስኤስ ማቴሪያል Co., Ltd.ከማይዝግ ብረት የተሰራ ስፌት በሌለው ቱቦዎች፣ በደማቅ አንጠልጣይ ቱቦዎች፣ እንከን የለሽ የተጠቀለለ ቱቦ ወዘተ ልዩ የሆነ መሪ አምራች ነው።ደንበኞችን ለማቀላጠፍ የተጣጣሙ ቱቦዎች እና ቱቦዎችም አሉን.ሊያኦቼንግ ሲሄ ኤስኤስ ማቴሪያል Co., Ltd.በጣም የላቀ የማምረቻ እና የመመርመሪያ መሳሪያዎች አሉት.የእርስዎን ፍላጎት ሙሉ በሙሉ ማሟላት እንችላለን።በስታንዳርድ በጣም ጥብቅ በሆነ መልኩ በእኛ የሚመረቱ ቱቦዎች ሁልጊዜ ትክክለኛ የኦዲ እና የ WT መቻቻል አላቸው።የመቻቻል መቆጣጠሪያው በምርት ደረጃዎች መሠረት ነው ።ምርቶቻችን ሁል ጊዜ በደንበኞች ይረካሉ።ደንበኞቻችን ምርቶቻችንን ገዙ ተጨማሪ ትርፍ ፈጥረዋል።
ሀ) OD (የውጭ ዲያሜትር): 3.18 ሚሜ እስከ 101.6 ሚሜ
ለ) WT (የግድግዳ ውፍረት): 0.5mm እስከ 20mm
ሐ) ርዝመት: በደንበኛው ፍላጎት መሰረት
መ) ደረጃዎች፡ ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ወዘተ
ሠ) የሂደት ዘዴ፡ ERW፣ EFW ወዘተ

በእያንዳንዱ ስላይድ ሶስት መጣጥፎችን የሚያሳዩ ተንሸራታቾች።በተንሸራታቾች ውስጥ ለመንቀሳቀስ የኋላ እና ቀጣይ ቁልፎችን ይጠቀሙ ፣ ወይም በእያንዳንዱ ስላይድ ውስጥ ለመንቀሳቀስ በመጨረሻው ላይ ያሉትን የስላይድ መቆጣጠሪያ ቁልፎችን ይጠቀሙ።
የራስ ቅል ነርቭ ሴል ሴሎች (CNCC) የፅንሱን ነርቭ እጥፋት ዘግተው ወደ pharyngeal ቅስቶች ይፈልሳሉ።የ CNCC መታወክ በ orofacial cleft etiology ውስጥ ትልቅ ሚና ይጫወታል ፣ የተለመደ የትውልድ መበላሸት።ሄትሮዚጎስ SPECC1L ሚውቴሽን ያልተለመደ እና የሲንዶሚክ ስንጥቅ ባለባቸው በሽተኞች ውስጥ ተገኝቷል።እዚህ፣ የቀኖናዊ ተለጣፊ መጋጠሚያ (AJ) ክፍሎች፣ β-catenin እና ኢ-ካድሪን በሰለጠኑ የSPECC1L ተንኳሽ ህዋሶች የተሻሻለ ቀለምን እና የኤሌክትሮን ማይክሮግራፎች የ AJ apical-basal ስርጭትን ያሳያሉ።በ craniofacial morphogenesis ውስጥ የ SPECC1L ሚና ለመረዳት የ Specc1l ጉድለት ያለበት የመዳፊት ሞዴል ፈጠርን።Homozygous mutants ሽሎች ገዳይ ናቸው እና የተዳከመ የነርቭ ቱቦ መዘጋት እና የ CNCC ሽፋንን ያሳያሉ።የ AJ ፕሮቲን ቀለም በተለዋዋጭ የነርቭ እጥፋት ውስጥ ይጨምራል።ይህ የኤጄ ጉድለት ከ CNCC መፍታት ጉድለት ጋር የሚስማማ ነው፣ ይህም የኤጄን መፍረስ ይፈልጋል።በተጨማሪም Specc11 ሚውቴሽን የPI3K-AKT ምልክትን ቀንሷል እና አፖፕቶሲስን ጨምሯል።በብልቃጥ ውስጥ፣ የ PI3K-AKT ምልክት በዱር-አይነት ህዋሶች ውስጥ መጠነኛ መከልከል የኤጄ ለውጦችን ለማድረግ በቂ ነበር።በአስፈላጊ ሁኔታ፣ በSPECC1L ማንኳኳት የተከሰቱ የኤጄ ለውጦች በPI3K-AKT መንገዱን በማግበር ሊቀለበስ ይችላሉ።እነዚህ መረጃዎች አንድ ላይ ሆነው፣ SPECC1L፣ እንደ PI3K-AKT ምልክት እና ኤጄ ባዮሎጂ ልብ ወለድ ተቆጣጣሪ ለነርቭ ቱቦ መዘጋት እና ለ CNCC ስትራቲፊኬሽን እንደሚያስፈልግ ይጠቁማሉ።
Cranial neural crest ሕዋሶች (CNCCs) ወደ የጀርባው ኒውሮኢክቶደርም ይገለጻሉ እና ከኤፒተልየል-ሜሴንቺማል ሽግግር (ኢኤምቲ) 1,2,3 ጋር በመተባበር በማደግ ላይ ካሉት የነርቭ እጥፋቶች ኒውሮኤፒተልየም ይለያሉ.ፕሪሚግሬሽን ኤፒተልያል ሲኤንሲሲዎች የኢንተርሴሉላር መጋጠሚያዎችን ያበላሻሉ እና የሚፈልሱ mesenchymal CNCCዎች የመጀመሪያ እና ሁለተኛ የpharyngeal ቅስቶችን የሚሞሉ እና አብዛኛዎቹን የ craniofacial cartilage ይመሰርታሉ።ስለዚህ የ CNCC ተግባርን የሚቆጣጠሩት ጂኖች እንደ orofacial clefts ባሉ craniofacial congenital anomalies etiology ውስጥ ይስተጓጎላሉ።ከተወለዱ የአካል ጉድለቶች አንዱ8.
የሲ.ኤን.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ.ሲ (ዲላሚኔሽን) መቆረጥ (delamination) ከ 8.5 እስከ 9.5 ቀናት ባለው ጊዜ ውስጥ በአይጦች ውስጥ የፅንስ እድገት ከ 8.5 እስከ 9.5 ቀናት ባለው ጊዜ ውስጥ የፊተኛው የነርቭ ቱቦ ከተዘጋ ጋር ይዛመዳል.የበርካታ የአይጥ ኦሮፋሻል ስንጥቅ-የተያያዙ ጂኖች ሚውታንቶች Irf69,10፣ Ghrl310፣ Cfl111 እና Pdgfrα12ን ጨምሮ አንዳንድ አይነት የነርቭ ቱቦ ጉድለት ያሳያሉ።ነገር ግን የስፕሎች ሚውቴሽን መዳፊት (Pax3) በ CNCC ስትራቲፊሽን ወይም ፍልሰት 13,14 ላይ ምንም ተጽእኖ ሳያስከትል በነርቭ ቱቦ መዘጋት ላይ ጉድለቶችን ስለሚያሳይ የነርቭ ቱቦ መዘጋት እና የ CNCC ስትራቲፊሽን ሂደቶች እንደ ገለልተኛ ሊቆጠሩ ይችላሉ።ተጨማሪ የመዳፊት ሞዴሎች በ CNCC መበታተን እና የነርቭ ቱቦ መዘጋት ጉድለት ያለባቸው የእነዚህ ሁለት ሂደቶች የጋራ ሞለኪውላዊ መሰረትን ለመለየት ይረዳሉ።
የ CNCCን ከኒውሮኤፒተልየል ሴሎች ማግለል የፕሮቲን ውህዶችን ያቀፈ የማጣበቂያ መገናኛዎች (AJs) መሟሟት ይጠይቃል, ከነዚህም መካከል E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin እና α-actinin ከ actin filaments 2 ጋር የተያያዙ ናቸው. በነርቭ እጥፋት ውስጥ ኢ-ካድሪን ከመጠን በላይ የመገለጽ ጥናቶች የ CNCC ቅልጥፍናን መቀነስ ወይም መዘግየት አሳይተዋል።በተቃራኒው የኢ-ካድሪንን መጨቆን ቀደምት ስትራቲፊኬሽን15፣16 ያስከትላል።በ CNCC ስትራቲፊሽን ወቅት ኤምኤምትን የሚያስተናግዱት አብዛኛዎቹ ምክንያቶች ወደ ግልባጭ ሁኔታዎች (AP2α ፣ Id2 ፣ FOXD3 ፣ SNAIL ፣ TWIST ፣ SOX10) እና extracellular matrix (ECM) እንደ ማትሪክስ ሜታልሎፕሮቴይናሴስ (MMPs) ያሉ ፕሮቲኖችን የሚያስተካክሉ ናቸው ፣ነገር ግን CNCCs ቀጥተኛ የሳይቶስክሌትል AJ ተቆጣጣሪዎች ናቸው። እስካሁን አልታወቀም።የ PI3K-AKT መንገድ የኢ-ካድሪን ደረጃን በመቃወም ይታወቃል፣ በዋናነት ከካንሰር ጥናት17።በቅርብ ጊዜ የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት በPDGFα ላይ የተመሰረተ PI3K-AKT ምልክት በአይጦች ላይ መጥፋት ወደ ክራኒዮፋያል መዛባት ያመራል፣ ይህም የላንቃ እና የነርቭ ቱቦ ጉድለቶች12ን ጨምሮ።ነገር ግን፣ በPI3K-AKT መንገድ እና በኤጄ መረጋጋት መካከል በCNCC ስትራቲፊሽን መካከል ያለው ግንኙነት ግልጽ አይደለም።
ቀደም ሲል SPECC1L ከአፍ ወደ ዓይን የሚዘረጋ ከባድ ስንጥቅ ባለባቸው ሁለት ሰዎች ውስጥ የመጀመሪያው የሚውቴሽን ዘረ-መል (Oblique cleft) (ObFC) ወይም Tessier IV18 cleft በመባል ይታወቃል።የSPECC1L ሚውቴሽን በሁለት ባለ ብዙ ትውልድ ቤተሰቦች ውስጥ በራስ-ሰር የበላይነት ኦፒትስ ጂ/ቢቢቢ ሲንድረም (OMIM #145410) ተለይቷል፣ በዚህ በሽታ የተጠቁ ግለሰቦች ከፍተኛ ርቀትን እና የከንፈር መሰንጠቅን ያሳያሉ። .ከኦፒትዝ ጂ/ቢቢቢ ሲንድረም ውስጥ ከግማሽ በላይ የሚሆኑት ከኤክስ ጋር የተገናኙ ናቸው (OMIM #300000) እና ሚውቴሽን የሚከሰቱት በMID1 ጂን ውስጥ በሚውቴሽን ሲሆን ይህም ከማይክሮቱቡል ጋር የተያያዘ የሕዋስ አጽም ፕሮቲን 22 ን ያካትታል።SPECC1L፣ እንዲሁም ከማይክሮቱቡልስ እና ከአክቲን ሳይቶስኬልተን ጋር የተቆራኘ ፕሮቲን፣ በሴል ማጣበቅ እና ፍልሰት 18 ወቅት ለአክቲን ሳይቶስክሌት ለውጥ የሚያስፈልገውን ምልክት ሊያስተላልፍ እንደሚችል እንገምታለን።በብልቃጥ እና በቪቮ ጥናቶች፣ አሁን SPECC1Lን በPI3K-AKT ምልክት የ AJ መረጋጋትን እንደ ልብ ወለድ ተቆጣጣሪ እንገልፃለን።በሴሉላር ደረጃ, የ SPECC1L እጥረት የፓን-AKT ፕሮቲን መጠን መቀነስ እና የ AJ apical-basal ስርጭት መጨመር በ AKT መንገድ ኬሚካላዊ ማግበር ተወግዷል.በ Vivo ውስጥ፣ Specc11- ጉድለት ያለባቸው ሽሎች የተዳከመ የነርቭ ቱቦ መዘጋት እና የ CNCC መቆራረጥን መቀነስ ያሳያሉ።ስለዚህ, SPECC1L የፊት ቅርጽ በሚሰጥበት ጊዜ ለተለመደው የ CNCC ተግባር በሚያስፈልገው ከፍተኛ ቁጥጥር ባለው የሴል ማጣበቂያ ላይ የተመሰረተ ምልክት ይሠራል.
በሴሉላር ደረጃ የ SPECC1L ሚናን ለመለየት ቀደም ሲል የተገለጸውን የተረጋጋ ኦስቲኦሳርማ ሴል መስመር U2OS ጉድለት በ SPECC1L18 ተጠቅመንበታል።እነዚህ የተረጋጋ U2OS ሕዋሳት SPECC1L (kd) knockdown ጋር SPECC1L ቅጂዎች እና ፕሮቲኖች ውስጥ መጠነኛ (60-70%) ቅነሳ, ፍልሰት ውስጥ ጉድለቶች እና actin cytoskeleton 18. በአንጻሩ, አንድ ከባድ ጊዜያዊ ቅነሳ ውስጥ. SPECC1L ወደ ሚቶቲክ ጉድለቶች 23 እንዲመራ ታይቷል.ተጨማሪ ባህሪን ካገኘን በኋላ፣ የእኛ የተረጋጋ SPECC1L-kd ህዋሳቶች በጣም ከፍተኛ በሆነ የመገጣጠም ደረጃ ላይ ሞርፎሎጂን እንደቀየሩ ​​አገኘን (ምስል 1)።በዝቅተኛ መጋጠሚያ ላይ ያሉ የግለሰብ ቁጥጥር ሴሎች እና የ kd ሴሎች ተመሳሳይ ይመስላሉ (ምስል 1A፣D)።ከተዋሃዱ ከ24 ሰአታት በኋላ የቁጥጥር ህዋሶች ኩቦዮዳል ቅርጻቸውን ይዘው ቆይተዋል (ምስል 1B፣ E)፣ SPECC1L-kd ህዋሶች ሲረዝሙ (ምስል 1C፣ F)።የዚህ የሕዋስ ቅርጽ ለውጥ መጠን የቁጥጥር ሴሎችን እና የ kd ሕዋሳትን (ፊልም 1) በ vivo የቀጥታ ምስል ምስል ተይዟል.በሴሎች ውስጥ የ SPECC1L ሚና ለመወሰን በመጀመሪያ አገላለጹን መርምረናል።የSPECC1L ፕሮቲን መጠን ሲዋሃድ ሲጨምር (ምስል 1G)፣ የ SPECC1L ግልባጭ ግን አልጨመረም (ምስል 1H) አግኝተናል።በተጨማሪም የሴል እፍጋት እየጨመረ ሲሄድ SPECC1L ፕሮቲን በሴሉላር ድንበሮች (ምስል 2A-E) ላይ ተከማችቷል, ከሜምብራል-የተገናኘ β-catenin (ምስል 2A'-E') ጋር መደራረብ.ከSPECC1L ከአክቲን ሳይቶስkeleton 18፣23 ጋር ያለውን ግንኙነት ስንመለከት SPECC1L በአክቲን ላይ ከተመሰረቱ የማጣበቂያ መገናኛዎች (AJ) ጋር እንደሚገናኝ ገምተናል።
(AF) SPECC1L knockdown (DF) ሴሎች ከ U2OS ሕዋሳት (AC) ቁጥጥር ጋር ሲነፃፀሩ በከፍተኛ ውህደት (ኤፍ) ይረዝማሉ።ለተለያዩ የሕዋስ እፍጋቶች ከመረጥናቸው ስድስት የጊዜ ነጥቦች (T1፣ T3፣ T6) ውስጥ ሦስቱ እዚህ ላይ ይታያሉ።(ጂ) የ SPECC1L ፕሮቲን ከቁጥጥር ህዋሶች ዝቅተኛ ውህደት ጋር ሲነፃፀር በከፍተኛ ደረጃ መረጋጋትን ያሳያል።የ SPECC1L የምዕራባዊ ብልት የሚጠበቀውን 120 ኪዳ ባንድ እና ከፍ ያለ የሞለኪውል ክብደት ባንድ ያሳያል፣ ምናልባትም ከትርጉም በኋላ የተሻሻለ (*).ለዝቅተኛ እና ለከፍተኛ ውህደት በተመሳሳይ ሁኔታ የምዕራባውያን ነጠብጣብ ትንተና ተካሂዷል።SPECC1L ዝቅተኛ እና ከፍተኛ መጋጠሚያ ላይ የሚያሳዩ ምስሎች ከተመሳሳይ ነጠብጣብ የተወሰዱ ናቸው.ተመሳሳይ ነጠብጣብ ተወግዶ በ β-actin ፀረ እንግዳ አካላት እንደገና ተመርምሯል.(H) የቁጥር RT-PCR ትንታኔ በSPECC1L ግልባጭ ደረጃዎች ላይ ምንም ጉልህ ለውጦች አላሳየም።የስህተት አሞሌዎች ከአራት ገለልተኛ ሙከራዎች SEMዎችን ይወክላሉ።
(AE) የሕዋስ ቅርጽ ትንተናን መደበኛ ለማድረግ እና በ SPECC1L knockdown (kd) በ U2OS ሕዋሳት ላይ የAJ ለውጦችን ለማድረግ የተለያዩ የሕዋስ እፍጋቶችን የሚወክል ስድስት የጊዜ ነጥቦችን (T1-T6) መረጥን።ከእነዚህ የጊዜ ነጥቦች ውስጥ የመጀመሪያዎቹ አምስቱ ነጠላ ሕዋሶች (T1)፣ ከ50-70% የትናንሽ ሕዋስ ስብስቦች (T2) ውህደት፣ kd ሕዋሳትን እንደገና ሳይቀይሩ (T3)፣ የ kd ሴሎችን (T4) እና የ24 ሰዓት ለውጦችን ያካትታሉ።በ kd (T5) ሕዋሳት የኋላ ቅርጽ.የ SPECC1L ፕሮቲን በብዛት በሳይቶፕላዝም ውስጥ በቲ 1 (A) ውስጥ ተበታትኖ ነበር፣ ነገር ግን ክምችቱ በሴሉላር ድንበሮች በቀጣዮቹ የጊዜ ነጥቦች (B-E፣ ቀስቶች) ላይ ታይቷል።(FJ) β-catenin ከ AJ ውስብስብ ጋር በተያያዙ ኢንተርሴሉላር ድንበሮች ላይ ተመሳሳይ ክምችት ያሳያል።(A'-E') SPECC1L እና β-catenin በከፍተኛ ሕዋስ ጥግግት (ቀስቶች) ላይ በሴል ድንበሮች ላይ ተደራራቢ ቀለም ያሳያሉ።(F'-J') በ SPECC1L-kd ሴሎች ውስጥ፣ β-catenin ማቅለም በዝቅተኛ የሴል እፍጋት (F'-H') መደበኛ ሆኖ ይታያል፣ ነገር ግን የሕዋስ ቅርፅ ሲቀየር (I', J'; ቀስቶች) እየሰፋ ይሄዳል፣ ይህም AJ መሆኑን ያሳያል። ተለውጠዋል።አሞሌዎች = 10 µm
ከዚያም የSPECC1L ጉድለት በኤጄ ላይ ያለውን ተጽእኖ ለማወቅ ሞክረናል።ቀኖናዊ ክፍሎችን F-actin፣ myosin IIb፣ β-catenin እና E-cadherin24,25,26,27ን ጨምሮ በርካታ ከኤጄ ጋር የተገናኙ ማርከሮችን ተጠቀምን።ቀደም ሲል እንደተገለፀው በ SPECC1L-kd ሴሎች ውስጥ የአክቲን ውጥረት ፋይበር ጨምሯል (ምስል 3A, B) 18 .ከአክቲን ክሮች ጋር የተያያዘው Myosin IIb በቫይሮ ውስጥ በ SPECC1L-kd ሴሎች ውስጥ ተመሳሳይ ጭማሪ አሳይቷል (ምስል 3C, D).ከኤጄ ጋር የተገናኘ β-catenin በሴል ሽፋን ላይ ከካድሪን ጋር ይጣመራል, ይህም በመደበኛ የ "ማር ወለላ" አገላለጽ በቁጥጥር ኩብሳይትስ (ምስል 3E,G) ውስጥ ያሳያል.የሚገርመው፣ ኮንፎካል ማይክሮስኮፒን በመጠቀም ጠፍጣፋ ምስሎች ላይ፣ β-catenin (ምስል 3E፣F) እና ኢ-ካድሪን (ምስል 3ጂ፣ኤች) በተጣመሩ የ SPECC1L ጉድለት ህዋሶች የሴል ሽፋን ላይ ቀለም መቀባት የተራዘመ ቀለም ያላቸውን ምልክቶች ያሳያሉ።ይህ በ kd ሕዋሳት ውስጥ ያለው ከኤጄ ጋር የተገናኘ β-catenin ቀለም መስፋፋት በተዋሃዱበት ጊዜ ጎልቶ ይታያል፣ነገር ግን የሕዋስ ቅርጽ ለውጦችን የሚቀድም ይመስላል (ምስል 2F-J፣ F'-J')።የዚህን የተራዘመ ኤጄ ቀለም አካላዊ ተፈጥሮ ለማወቅ በኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒ (TEM) በማስተላለፍ በ SPECC1L-kd U2OS ሕዋሳት ላይ ባለው የ apical-basal ገጽ ላይ የሕዋስ ድንበሮችን መርምረናል (ምስል 3I,J)።ከቁጥጥር ሴሎች (ምስል 3I) በተለየ የ AJ (ቀስቶች) የሚጠቁሙ የተለያዩ ኤሌክትሮኖች ጥቅጥቅ ያሉ ክልሎች ነበሯቸው ፣ kd ሕዋሳት (ምስል 3ጄ) በአፒኮባሳል አውሮፕላን ውስጥ የኤጄን ከፍተኛ የኤሌክትሮን መጠጋጋትን የሚያመለክቱ ትላልቅ እና ተያያዥ ክልሎች አሳይተዋል።.በተጨማሪም ፣ በተለዋዋጭ ክፍሎች ላይ ፣ በ kd ሴሎች ውስጥ ሰፊ የሴል ሽፋን እጥፎችን አስተውለናል (ምስል S1A ፣ B) ፣ ይህም የ β-catenin እና E-cadherin የእድፍ ባንዶችን (ምስል 3F,H) የተዘረጋውን ንድፍ ያብራራል ።በ AJs ውስጥ የ SPECC1L ሚናን ለመደገፍ, β-catenin ከ SPECC1L ጋር በተዋሃዱ የ U2OS ሕዋሳት (ምስል 3 ኪ) ውስጥ በክትባት ተካቷል.ከተራዘመ የበሽታ መከላከያ ለኤጄ ማርከሮች ጋር፣ የTEM ትንታኔ ከኛ መላምት ጋር የሚስማማ ነበር የSPECC1L እጥረት የAJ apical-basal density እና ልዩነትን ይጨምራል።
(AH) በ kd ሴሎች ውስጥ በ 48 ሰአታት ውስጥ የኤፍ-አክቲን ቀለም መጨመር (T6; A, B).ከF-actin (C, D) ጋር የተያያዘ የ myosin IIb ቀለም የተቀየረ.በ SPECC1L-kd (F, H) ህዋሶች ውስጥ የ β-catenin እና E-cadherin membrane ቀለም በመቆጣጠሪያ ሴሎች (E, G) ውስጥ ያለው ለስላሳ ንድፍ ተሻሽሏል.አሞሌዎች = 10 µm(I-J) የ apical-basal intercellular መገናኛን የሚመለከቱ ኤሌክትሮኖች ማይክሮግራፎች።የቁጥጥር ሴሎች ተለጣፊ መገናኛዎችን (I፣ ቀስቶች) የሚያመለክቱ የተለያዩ ኤሌክትሮን-ጥቅጥቅ ያሉ ክልሎችን ያሳያሉ።በአንጻሩ በ SPECC1L-kd ሴሎች ውስጥ ያለው አጠቃላይ የ apical-basal መስቀለኛ መንገድ ኤሌክትሮን ጥቅጥቅ ያለ (ጄ፣ ቀስቶች) ታየ፣ ይህም የመጠን መጨመር እና የማጣበቂያ መገናኛዎች መበታተንን ያሳያል።(K) β-catenin ከ SPECC1L ጋር በተዋሃዱ የU2OS ሴል lysates ውስጥ በክትባት ተካቷል።ከአራቱ ገለልተኛ ሙከራዎች ውስጥ አንዱን የሚወክል ምስል ከአንድ ቦታ የተወሰደ።
በ craniofacial morphogenesis ውስጥ የ SPECC1L ሚና ለመረዳት ፣ ሁለት ገለልተኛ የ ES trap cell መስመሮችን DTM096 እና RRH048 (BayGnomics ፣ CA) በመጠቀም የ Specc1l ጉድለትን ሞዴል ፈጠርን ኢንትሮን 1ን ይወክላሉ እና Specc1l ትራንስክሪፕቶች በ 15 ተይዘዋል (ምስል 1) .4A፣ ምስል S2)የዲኮይ ቬክተር ማስገቢያ ጂኖሚክ ቦታ የሚወሰነው በጂኖም ቅደም ተከተል እና በ PCR (ምስል S2) የተረጋገጠ ነው.ሁለቱም የጂን ወጥመድ ዲዛይኖች ሲያዙ የ Specc11-lacZ ዘጋቢዎችን በፍሬም ውስጥ እንዲዋሃዱ ፈቅደዋል።ስለዚህ, በ X-gal ማቅለሚያ የሚወሰነው የ lacZ አገላለጽ እንደ Specc11 አገላለጽ አመልካች ጥቅም ላይ ውሏል.ሁለቱም alleles ተመሳሳይ የላክዜድ አገላለጽ ንድፎችን አሳይተዋል፣ በ intron 1 ውስጥ ያለው DTM096 የጂን ወጥመድ ከ RRH048 በ intron 15 (አይታይም) የበለጠ ጠንካራ አገላለጽ ያሳያል።ይሁን እንጂ Specc1l በሰፊው ይገለጻል, በተለይም በነርቭ እጥፋት በ E8.5 (ስእል 4B), በነርቭ ቱቦ እና የፊት ሂደቶች በ E9.5 እና E10.5 (ምስል 4C,D) እና እግሮችን በማዳበር ላይ ጠንካራ መግለጫዎች አሉት. በ E10.5 እና አይኖች (ምስል 4D).ቀደም ሲል የ SPECC1L አገላለጽ በ E10.5 የመጀመሪያው pharyngeal ቅስት ውስጥ በኤፒተልየም እና በታችኛው mesenchyme18 ውስጥ ከ CNCC የዘር ሐረግ ጋር እንደሚስማማ ዘግበናል።በ CNCC ውስጥ የ SPECC1L አገላለጽ ለመሞከር E8.5 የነርቭ እጥፋትን (ምስል 4E-J) እና E9.5 የራስ ቅል ክፍሎችን (ምስል 4K-) አከናውነናል.በ E8.5, SPECC1L በ NCC ማርከሮች (ምስል 4 ጂ, ጄ) የተበከሉ ሴሎችን ጨምሮ የነርቭ እጥፋት በከፍተኛ ሁኔታ (ምስል 4E, H).በE9.5፣ SPECC1L (ምስል 4K፣ N) በጠንካራ የተበከለ ማይግራንት ሲኤንሲሲ ከAP2A (ምስል 4L፣ M) ወይም SOX10 (ምስል 4O፣ P) ጋር።
(ሀ) የመዳፊት Specc11 ዘረ-መል (ጅን) በ ES DTM096 (ኢንትሮን 1) እና RRH048 (ኢንትሮን 15) የሴል ክሎኖች ውስጥ የማታለያ ቬክተር ማስገባትን ያሳያል።(BD) lacZ የ heterozygous Specc1lDTM096 ሽሎች የ Specc1l መግለጫን የሚወክሉ ከ E8.5 እስከ E10.5።NE = neuroectoderm, NF = የነርቭ እጥፋት, PA1 = የመጀመሪያ pharyngeal ቅስት.(EP) SPECC1L የበሽታ መከላከያ ከኤን.ሲ.ሲ ማርከሮች AP2A እና SOX10 በ E8.5 (ኤንኤፍ; ኢጄ) የነርቭ እጥፋት እና E9.5 (KP) የራስ ቅል ክፍሎች።የ SPECC1L ቀለም በ AP2A (F, G; የቀስት ራስ) እና SOX10 (I, J; ቀስቶች) የተሰየሙ ሴሎችን ጨምሮ በነርቭ እጥፋት E8.5 (E, H; የቀስት ራስጌዎች) ላይ በስፋት ተስተውሏል.በE9.5፣ SPECC1L AP2A (L፣ M; ቀስቶች) እና SOX10 (O፣ P; ቀስቶች) የተሰየሙ የሚፈልሱ CNCCs (K፣ N; ቀስቶች) በጠንካራ ቀለም ቀባ።
በ heterozygous Specc1lDTM096/+ እና Specc1lRRH048/+ አይጦች መካከል መሻገር የሚያሳየው ሁለቱ የጂን ወጥመድ አሌሎች ተጨማሪ አለመሆናቸውን እና ለጂን ወጥመድ አሌሌ ውህድ ሄትሮዚጎት እና ፅንሥ ሆሞዚጎት ለፅንስ ​​ገዳይ መሆናቸውን ያሳያል (ሠንጠረዥ S1)።Mendelian ሬሾዎች በወሊድ ጊዜ (1.34 vs. 2.0 የሚጠበቀው) heterozygotes በሕይወት የመትረፍ መጠን መቀነስ አመልክተዋል.በ heterozygotes መካከል ዝቅተኛ የወሊድ መሞትን አስተውለናል ፣ አንዳንዶች የራስ ቅል (craniofacial anomalies) ነበሩት (ምስል S3)።ነገር ግን፣ የእነዚህ የፐርናታል ክራንዮፋሻል ፊኖታይፕስ ዝቅተኛ ዘልቆ የእነርሱን ሥር የሰደደ የፓቶፊዮሎጂ ዘዴ ለማጥናት አስቸጋሪ ያደርገዋል።ስለዚህ፣ በፅንስ ገዳይ ፍኖታይፕ ላይ አተኩረን homozygous Specc11 mutants።
አብዛኞቹ ውሁድ heterozygous ወይም homozygous Specc1lDTM096/RRH048 የሚውቴሽን ሽሎች ከ E9.5-10.5 በኋላ አልዳበረም (ምስል 5A-D) እና የነርቭ ቱቦ ወደ ፊት አልተዘጋም (ምስል 5B, D) እና አንዳንድ ጊዜ ከኋላ ተዘግቷል (አይታይም) ..ይህ የራስ ቅል ነርቭ ቱቦ መዘጋት ጉድለት በኤ10.5 ላይ ከቀሩት የ CNCC ምልክት DLX2 ጋር የተያያዘ ሲሆን ይህም ምንም መከፋፈል እንደሌለ ያሳያል (ምስል 5A'-D')።የ CNCC አጠቃላይ መጠንም መቀነሱን ለማወቅ የ CNCC መስመሮችን ከጂኤፍፒ ጋር በጂን ወጥመድ መስመሮቻችን Wnt1-Cre እና ROSAmTmG ላይ መለያ ሰጥተናል።የተደረደሩ ጂኤፍፒ+ኤንሲሲ እና ጂኤፍፒ-(RFP+) ያልሆኑ ኤንሲሲ ከሙሉ ፅንሶች እንልካለን።በ E9.5, ፍሰት-የተደረደሩ የጂኤፍፒ ምልክት የተደረገባቸው CNCCs በ WT እና በሚውቴሽን ሽሎች መካከል ጉልህ ለውጥ አላደረጉም (አይታዩም) ይህም የተለመደው የ CNCC ዝርዝር መግለጫን ያሳያል።ስለዚህ፣ በ SPECC1L-kd ሕዋሳት ላይ እንደሚታየው የቀረው Wnt1-Cre እና DLX2 ቀለም በተጋለጡ የነርቭ እጥፋት (ምስል 5B') ጉድለት የCNCC ንብርብር ምክንያት ሊሆን ይችላል ብለን ገምተናል።በነርቭ እጥፋት ውስጥ የሲኤንሲሲ መኖሩን ለማረጋገጥ የ NCC ማርከሮች SOX10, AP2A እና DLX2 ተጠቀምን (ምስል 5E-R).በ E8.5, ለሶስቱም የኤን.ሲ.ሲ ጠቋሚዎች የነርቭ እጥፋት ቀለም በ WT ክፍሎች (ምስል 5E, G, I) እና Specc1l mutant (ምስል 5F, H, J).በ E9.5፣ የኤን.ሲ.ሲ ማርከሮች ወደ ማይግሬሽን NCC በ WT ክፍሎች (ምስል 5M፣ O, Q) ላይ ቀለም ሲቀባ፣ ቀሪው የ NCC ቀለም በ Specc1l ሙታንት ሽሎች (ምስል 5N፣ P፣ R) የተጋለጡ የነርቭ እጥፋት ታይቷል።SOX10 እና DLX2 የሚሰደዱ CNCCs ምልክት ስላደረጉ፣ ይህ ውጤት የ SPECC1L ጉድለት ያለባቸው CNCCዎች ከስደት በኋላ ዝርዝር መግለጫን ያገኛሉ ነገርግን ከነርቭ እጥፋት ማይሰደዱ ተስኗቸዋል።
የ Specc11 እጥረት ወደ ጉድለት የነርቭ ቱቦ መዘጋት፣ የራስ ቅል ነርቭ ክራስት ህዋሶችን እና ኤጄዎችን ማጥፋትን ያስከትላል።
(A፣ B') E9.5 WT (A) ፅንስ በWnt1-Cre (A') የተሰየመ የሚፈልሱ የራስ ቅል ነርቭ ክሬስት ሴሎችን (CNCC) ተሸክሟል።በአንጻሩ Specc11 የሚውቴሽን ሽሎች ያልተሰደዱ ክፍት የነርቭ እጥፋት (ቢ) እና ሲኤንሲሲዎች ያሳያሉ (B'፣ የቀስት ራሶች)።(C፣ D') ብሩህ የመስክ ምስሎች (C፣ D') እና የበሽታ መከላከያ (C'፣ D') የ CNCC ማርከር DLX2 የ E10.5 WT ሽሎች (C፣ C') እና Specc1l (D፣ D')።በ WT E10.5 ሽሎች፣ DLX2-positive CNCC የጊል ቅስቶችን (C'፣ ቀስቶች) በቅኝ ግዛት ይገዛቸዋል፣ በሚውቴሽን ውስጥ ደግሞ ግልጽ የሆነ ማቅለሚያ በክፍት የነርቭ እጥፋት (D'፣ ቀስቶች) እና በመጀመሪያዎቹ የፍራንነክስ ቅስቶች (D' ቀስቶች).) ከአንዳንድ ማቅለሚያዎች (ፍላጻዎች) ጋር ደካማ መጥፋት እና የ CNCC ፍልሰትን የሚያመለክቱ።ER) በደረጃ E8.5 (E-L) እና E9.5 (M–R) ላይ ያሉት የWT እና Specc1l የሚውቴሽን ሽሎች ክፍሎች በNCC ማርከሮች SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H,) ተለጥፈዋል. ኦ፣ ፒ) እና DLX2 (I፣ J፣ Q፣ R)።በ E8.5, የኤን.ሲ.ሲ ቀለም በዱር-አይነት የነርቭ እጥፋት (ኤንኤፍ) እና በሚውቴሽን ክፍሎች ውስጥ ታይቷል.የ SOX10 እና β-catenin በ E8.5 WT (K) እና mutant (L) ውስጥ በጋራ መቀባቱ በነርቭ እጥፎች ውስጥ ባሉ የሕዋስ ወሰኖች ላይ የ β-catenin ቀለም መጨመሩን ያሳያል።በE9.5፣ የሚፈልሱ ሲኤንሲሲዎች (M፣ O፣ Q) የዱር ዓይነት ቀለም ታይቷል፣ በሚውቴሽን ውስጥ ግን ያልተስተካከሉ CNCCs ክፍት የነርቭ እጥፋትን (N፣ P፣ R) ለብሰዋል።(S–Z) In Vivo AJ መለያ ትንተና በWT እና Specc11DTM096/RRH048 ሽሎች በ E9.5 ሚውቴሽን ኮርኒናል ክፍሎች።በላይኛው ቀኝ ጥግ ላይ ግምታዊ የሴክሽን አውሮፕላን ይታያል።በተለዋዋጭ ቲሹዎች ክፍሎች ውስጥ የኤፍ-አክቲን (ኤስ, ቲ) እና myosin IIb (U, V) መጨመር ታይቷል.በምስል 3 ላይ ካለው የ in vitro ውጤቶች ጋር ተመሳሳይ በሆነ መልኩ፣ በተለዋዋጭ ፅንሶች ውስጥ፣ ለ β-catenin (W፣ X) እና E-cadherin (Y, Z) የተሻሻለ የሽፋን ቀለም ታይቷል።(AA-BB) የዱር-አይነት ሽል ክፍል ከአፕቲካል-ባሳል ሴል ድንበር ባሻገር የሚመለከት ኤሌክትሮን ማይክሮግራፍ የተለየ ኤሌክትሮን-ጥቅጥቅ ያለ ክልል የማጣበቂያ መገናኛዎችን (AA, ቀስቶችን) ያሳያል.በአንጻሩ በSecc11 የሚውቴሽን ሽሎች (ቢቢ፣ ቀስቶች) ክፍሎች፣ አጠቃላይ አፒኮባሳል መጋጠሚያ በኤሌክትሮን ጥቅጥቅ ያለ ነው፣ ይህም የጨመረው ጥግግት እና የማጣበቂያ መገናኛዎች መበታተንን ያሳያል።
የንብርብር መቀነሱ በተለወጠው AJ ምክንያት ነው የሚለውን መላምታችንን ለመፈተሽ የAJ መለያን በ Specc1l ሚውቴሽን ሽሎች (ምስል 5S-Z) ላይ በተጋለጡ የነርቭ እጥፋት ውስጥ መርምረናል።የአክቲን የጭንቀት ፋይበር (ምስል 5S, T) መጨመር እና የ myosin IIB ቀለም በአክቲን ፋይበር (ምስል 5U, V) ላይ መጨመር አስተውለናል.በአስፈላጊ ሁኔታ በሴሉላር ድንበሮች ላይ የ β-catenin (ምስል 5W, X) እና ኢ-ካድሪን (ምስል 5Y, Z) መጨመርን ተመልክተናል.በተጨማሪም የኤን.ሲ.ሲ. የ β-catenin ቀለምን በ E8.5 ሽሎች የነርቭ እጥፋት ውስጥ መርምረናል (ምስል 5K, L).β-catenin ቀለም በ Specc1l mutant neural folds (ምስል 5L እና K) ላይ ጠንካራ ሆኖ የታየ ሲሆን ይህም የኤጄ ለውጦች መጀመሩን ይጠቁማል።በE9.5 ሽሎች የራስ ቅል ክፍሎች ውስጥ በኤሌክትሮን ማይክሮግራፍ ውስጥ ፣ ከ WT (ምስል 5AA ፣ BB እና S1E-H) ጋር ሲነፃፀር በ Specc1l በሚውቴሽን ሽሎች ውስጥ የተንሰራፋ የኤሌክትሮን ጥቅጥቅ ያለ እድፍ መጨመር አስተውለናል።አንድ ላይ ሲደመር፣ እነዚህ ውጤቶች በSPECC1L-kd U2OS ሴሎች ውስጥ ያለን የ in vitro ውጤታቸውን ይደግፋሉ እና የተዛባ AJ ቀለም በእኛ ተለዋዋጭ ሽሎች ውስጥ ከ CNCC ስተራቲፊሽን ይቀድማል።
በኤኬቲ እንቅስቃሴ እና በ ኢ-ካድሪን መረጋጋት መካከል ያለውን የታወቀ ተቃራኒ ግንኙነት ስንመለከት፣17,28 የPI3K-AKT ምልክትን ተሳትፎ መላምት አድርገናል።በተጨማሪም፣ በአንዳንድ የኛ ሚውቴሽን ፅንሶች ላይ ከሞት ያመለጡ (<5%) በ E9.5-10.5 እና በምትኩ በ E13.5 (ምስል S3) አካባቢ የሰፈሩትን የሱቤፒደርማል አረፋ ተመልክተናል።የሱቤፒደርማል ቬሴሎች በPDGFRα12 ላይ የተመሰረተ የተቀነሰ የPI3K-AKT ምልክት ምልክት ነው።Fantauzzo እና ሌሎች.(2014) በPdgfraPI3K/PI3K ሚውቴሽን ሽሎች ውስጥ በPDGFRα ላይ የተመሰረተ PI3K ማግበር መቋረጥ የሱብፒደርማል ቬሶሴሎች፣የነርቭ ቱቦ ጉድለቶች እና የላንቃ ፍንጣቂዎች እንደሚያስከትል ዘግቧል።በእርግጥ፣ የፓን-AKT እና የነቃ phosphorylated Ser473-AKT ደረጃዎች በ Specc1l የሚውቴሽን ቲሹዎች ወደ E9.5 የፅንስ መጨናነቅ (ምስል 6A-D) ቀንሰዋል።የ phosphorylated Ser473-AKT መጠን መቀነስ ሙሉ በሙሉ በፓን-AKT በ vivo (FIG. 6E) እና in vitro (FIG. 6F) ውስጥ በመቀነሱ ምክንያት ሊሆን ይችላል።የ in vitro ቅነሳ የሚታየው U2OS ሕዋሳት ከሴል ቅርፅ እና የ AJ ጥግግት ለውጦች ጋር በጥብቅ ሲጣመሩ ብቻ ነው (ምስል 6D)።ስለዚህ፣ መረጃዎቻችን SPECC1L በ craniofacial morphogenesis ውስጥ የPI3K-AKT ምልክት አዲስ አወንታዊ ተቆጣጣሪ እንደሆነ ይጠቁማሉ።
(A–E) E8.5 (A,B) እና E9.5 (C,D) የራስ ቅል ክፍሎች ወይም E9.5 lysates ከ Specc1l mutant ሽሎች (E) የነቃ ፎስፈረስላይትድ S473-AKT እና የፓን-AKT ፕሮቲን ቅነሳ ደረጃዎችን ያሳያሉ። , ከቁጥጥር WT ጋር ሲነጻጸር.የምዕራባውያን መጥፋት በዱር-አይነት lysates እና በሚውቴሽን lysates ላይ በተመሳሳይ ሁኔታ ተከናውኗል።ለ SPECC1L የሚታዩት ምስሎች የተወሰዱት ከአንድ ነጥብ ነው።ተመሳሳይ ነጠብጣብ ተወግዶ በፀረ-ፓን-ኤሲቲ እና β-አክቲን ፀረ እንግዳ አካላት እንደገና ተመርምሯል።በ E8.5 የነርቭ እጥፋት (A, B) እና በ E9.5 የራስ ቅል ክፍሎች ውስጥ ያለው የፎስፈረስላይትድ S473-AKT ደረጃዎች በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሰዋል።(ኤፍ) የSPECC1L-kd U2OS ሕዋሳት በከፍተኛ መጋጠሚያ ላይ በተሰበሰቡ lysates ውስጥ የፓን-AKT መጠን በተመሳሳይ መልኩ ቀንሷል።የስህተት አሞሌዎች SEMsን ከሶስት ገለልተኛ የምዕራባውያን የብሎት መጠኖች ይወክላሉ።(ጂጄ) በ E9.5 ላይ ያሉት የWT ሽሎች ክፍሎች በKI67 የተበከሉ እና የተሰነጠቀ caspase 3፣ በቅደም ተከተል የሕዋስ መስፋፋትን (ጂ፣ጂ') እና አነስተኛ የአፖፖቲክ እንቅስቃሴን (H፣H') ያሳያሉ።Specc11 ሚውታንት ፅንሶች በንፅፅር የሴል እድገትን (I) ያሳያሉ, ነገር ግን በአፖፕቶሲስ ውስጥ ያሉ ሴሎች ቁጥር በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል (J).
ከዚያም የመስፋፋት እና የአፖፕቶሲስ ምልክቶችን መርምረናል.በ E9.5 ሽሎች መስፋፋት ላይ ምንም አይነት ልዩነት አላየንም (ምስል 6E, G ከ I ጋር ሲነጻጸር) ከ 82.5% የ WT ሚውቴሽን እና 86.5% ለ Specc1l ሚውታንቶች በ KI67 ማቅለሚያ (p <0.56, Fisher's) ይለካሉ. ትክክለኛ ሙከራ).በተመሳሳይ፣ ፅንሱ እስኪያያዘ ድረስ (አይታይም) (አይታይም) በE8.5 ላይ ለተሰነጣጠለ ካስፓዝ 3 ላይ በነርቭ እጥፋት ላይ በመቀባት በሚለካው አፖፕቶሲስ ላይ ምንም አይነት ልዩነት አላየንም።በአንጻሩ አፖፕቶሲስ በሁሉም የ E9.5 ሚውቴሽን ሽሎች (ምስል 6F, H እና J) ላይ በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል.ይህ አጠቃላይ የአፖፕቶሲስ ጭማሪ ከተቀነሰ PI3K-AKT ምልክት እና ቀደምት ፅንስ ገዳይነት29,30,31 ጋር የሚስማማ ነው።
በመቀጠል፣ ለ PI3K-AKT ምልክት በ AJ ለውጦች በእኛ kd ሴሎች ውስጥ ያለውን የምክንያት ሚና ለማረጋገጥ፣ በኬሚካላዊ መንገድ የቁጥጥር እና የ kd ህዋሶችን ቀይረናል (ምስል 7A-F)።የረጅሙን ልኬት (ርዝመት) ሬሾን ከተዛማጅ አቀባዊ ልኬት (ስፋት) ጋር በማነፃፀር በሴሎች SPECC1L-kd ውስጥ የሚታየውን የሕዋስ ቅርፅ ለውጥን እንደ ማርክ ተጠቅመንበታል።በአንጻራዊነት ክብ ወይም cuboidal ሕዋሶች የ 1 ሬሾ ይጠበቃል (ምስል 7G)።ከሴል ቅርጽ በተጨማሪ, በ β-catenin ማቅለሚያ (ምስል 7A'-F') በ AJ ላይ ያለውን ተጽእኖ አረጋግጠናል.ዎርትማንኒን በመጠቀም የ PI3K-AKT መንገድን መከልከል በቁጥጥር ሴሎች ውስጥ ያለውን የሕዋስ ቅርጽ ለመለወጥ በቂ ነበር (ምስል 7A,C) እና AJ (ምስል 7A').PI3K-AKT activator SC-79 በቁጥጥር ሴሎች ውስጥ የሕዋስ ቅርጽ (FIG. 7A, E) ወይም AJ መስፋፋት (FIG. 7A') ላይ ተጽዕኖ አላሳደረም.በ SPECC1L-kd ሴሎች ውስጥ፣ የ PI3K-AKT መንገዱን የበለጠ መጨቆኑ አፖፕቶሲስን (ምስል 7B,D) እና የ β-catenin ማቅለሚያ (ምስል 7B') ከፍተኛ ጭማሪ አስከትሏል፣ ይህም ከኛ ኢንቫይቮ ከባድ ሚውቴሽን ጋር ይጣጣማል።በአስፈላጊ ሁኔታ፣ የPI3K-AKT መንገድን ማግበር የሕዋስ ቅርፅን በእጅጉ አሻሽሏል (ምስል 7B፣F) እና AJ phenotypes (ምስል 7B”)።የሕዋስ ቅርጽ ለውጦች በሴል ክብ ቅርጽ ጥምርታ (ሲሲአር) እና ከላይ እንደተገለፀው ከትርጉም ጋር ሲነጻጸሩ (FIG. 7G)።በእርግጥም, በቁጥጥር ሴሎች ውስጥ (ምስል 7G, CCR = 1.56), የዎርትማንኒን ሕክምና የሕዋስ ቅርፅን በከፍተኛ ሁኔታ ለመለወጥ በቂ ነው (ምስል 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) ከሚታየው ጋር ተመሳሳይነት አለው. በ SPECC1L.-kd ሕዋሳት (ምስል 7G, CCR = 3.46).የ SPECC1L-kd ሴሎች የ Wortmannin ሕክምና (ምስል 7G, CCR = 3.60, ቸልተኛ) ከማይታከሙ የ kd ህዋሶች (ምስል 7G, CCR = 3.46, ቸልተኛ) ወይም ዎርትማንኒን-የተያዙ የቁጥጥር ሴሎች (ምስል 7G)., CCR = 3.46, ቸልተኛ) በተጨማሪም የሕዋስ ማራዘሚያ (7G, CCR = 3.61, ቸልተኛ) ይነካል.ከሁሉም በላይ፣ SC-79 AKT activator የተራዘመውን የ SPECC1L-kd ሴሎችን (ምስል 7G፣ CCR = 1.74፣ p <6.2 × 10-12) መልሷል።እነዚህ ውጤቶች SPECC1L የ PI3K-AKT ምልክትን እንደሚቆጣጠር ያረጋግጣሉ እና የ SPECC1L መጠነኛ መቀነስ የሕዋስ ማጣበቂያ ላይ ተጽዕኖ እንደሚያሳድር ይጠቁማሉ ፣ ጠንካራ ቅነሳ ደግሞ ወደ አፖፕቶሲስ ይመራል (ምስል 8)።
(A–F') ቁጥጥር (A, C, E) እና SPECC1L-kd (B, D, F) ሕዋሳት በPI3K-AKT መንገድ መከላከያ ዎርትማንኒን (C, D) ወይም SC-79 activator (E, F) ሕክምና ያልታከሙ የቁጥጥር ሴሎች cuboidal (A) ከመደበኛ β-cat ሴሉላር ቀለም (A') ጋር ሲሆኑ የ kd ህዋሶች ይረዝማሉ (B) በ β-cat spot (B') ይጨምራሉ.የ PI3K-AKT መንገዱን ከታገደ በኋላ የቁጥጥር ሴሎች ረዘሙ (C) በ β-cat ማስፋፊያ (C') ፣ kd ሴሎች ደግሞ አፖፕቶሲስ (ዲ) መታከም ጀመሩ ፣ ልክ እንደ እኛ በጣም ሚውቴሽን ሽሎች እና እጅግ በጣም የተሻሻለ β-cat ያሳያሉ።ማቅለም (D').የ PI3K-AKT መንገዱን ካነቃቁ በኋላ የቁጥጥር ሴሎች ኩቦዮዳል (ኢ) ይቆያሉ እና መደበኛ β-cat (E') ቀለም ያላቸው ሲሆን የ kd ሴሎች ደግሞ የተሻሻለ የሕዋስ ቅርፅ (F) እና β-cat (F') ማቅለሚያ አሳይተዋል ፣ ይህም ያሳያል ። (ጂ) በ(AF) ውስጥ ያለው የሕዋስ ቅርጽ ለውጥ መጠን በሴሉ ክብነት ሬሾ (ሲሲአር) ረጅሙ ልኬት (ርዝመት) እና ተዛማጅ ቋሚ ልኬት (ስፋት) በመጠቀም MetaMorph ሶፍትዌር በመጠቀም ይለካል።ያልታከሙ (NT) SPECC1L-kd ሴሎች (CCR = 3.46) ከቁጥጥር ሴሎች (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13) በጣም ረጅም ነበሩ.በሴሎች ቅርፅ (CCR=3.61, p<2.4×10-9) ላይ ተመሳሳይ ማራዘሚያን ለመፍጠር የዎርት የ PI3K-AKT መንገድን በቁጥጥር ሴሎች ውስጥ መከልከል በቂ ነበር።በተመሳሳይ ሁኔታ በ SPECC1L-kd ሴሎች ውስጥ በ SC-79 የ AKT ማግበር የሕዋስ ማራዘምን ወደ ቁጥጥር ደረጃዎች መልሰዋል (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).የዎርትማንኒን የ SPECC1L-kd ሕዋሳት አፖፕቶሲስን አስከትሏል ነገር ግን ምንም ተጨማሪ የሕዋስ ቅርጽ ለውጥ (CCR=3.60) ካልታከመ kd (CCR=3.46, ns) ወይም ዎርትማንኒን የታከሙ የቁጥጥር ሕዋሶች (3.61) ጋር ሲነጻጸር.ns = ምንም አይደለም.+/- የ SEM መለኪያዎች ለ 50 ሕዋሶች ይታያሉ.የስታቲስቲክስ ልዩነቶች የተማሪውን ቲ-ሙከራ በመጠቀም ይሰላሉ።
(ሀ) የ PI3K-AKT መንገድን መከልከል እና ማንቃት እንደቅደም ተከተላቸው የኤጄ ለውጦችን እና ማዳንን የሚያመለክት ንድፍ።(ለ) ለኤኬቲ ፕሮቲን ማረጋጊያ የቀረበው ሞዴል በ SPECC1L።
ቅድመ-ግኝት ሲኤንሲሲዎች ከቀድሞው የነርቭ እጥፋት ኒውሮኢፒተልያል ሴሎች 1,15,32 ለመለየት AJ lysis ያስፈልጋቸዋል.የ AJ ክፍሎች ቀለም መጨመር እና በ SPECC1L ጉድለት በሌሉት ሴሎች ውስጥ ያለው የ apical-basal AJ asymmetric ስርጭት ማጣት በብልት ውስጥም ሆነ በብልት ውስጥ ከ SPECC1L ለ β-catenin አካላዊ ቅርበት ጋር ተዳምሮ የ SPECC1L ተግባራት የ AJ አካባቢያዊ መረጋጋትን በአግባቡ እንዲጠብቁ ይጠቁማሉ. የድርጅት ጡንቻዎች.actin cytoskeleton.የ SPECC1L ከ actin cytoskeleton እና β-catenin ጋር ያለው ግንኙነት እና የ SPECC1L በማይኖርበት ጊዜ የተጨመቁ የአክቲን ክሮች መጨመር ከ AJ ጥግግት መጨመር ጋር ይጣጣማል.ሌላው አማራጭ በ SPECC1L ጉድለት ውስጥ ያሉ የአክቲን ፋይበርዎች ቁጥር መጨመር በሴሉላር ሴሉላር ውጥረት ላይ ለውጥ ያመጣል.ሴሉላር ውጥረት በ AJ 33 ተለዋዋጭነት ላይ ተጽእኖ ስለሚያሳድር, የቮልቴጅ ለውጦች የበለጠ የተበታተነ AJ 34 ሊያስከትሉ ይችላሉ.ስለዚህ ማንኛውም ለውጦች በ CNCC ንብርብሮች ላይ ተጽዕኖ ይኖራቸዋል.
Wnt1 የነርቭ ክራስት ሴሎችን በሚፈጥሩ የመጀመሪያዎቹ የነርቭ እጥፋት ውስጥ ይገለጻል።ስለዚህ፣ Wnt1-cre የዘር መከታተያ ሁለቱንም ቅድመ እና ፍልሰት NCC35ን ያመለክታል።ሆኖም፣ Wnt1 በተጨማሪም የጀርባ አንጎል ቲሹ ክሎኖችንም ከቀደምት የነርቭ እጥፋት የተገኙ 35,36 ያመላክታል፣ ይህም E9.5 mutants ለWnt1 ጠቋሚዎች በክፍት ነርቭ እጥፋት ውስጥ ያለን ቀለም CNCC ሳይሆን አይቀርም።ለኤን.ሲ.ሲ ማርከሮች AP2A እና SOX10 የእኛ አወንታዊ ቀለም የ Specc11 mutant ሽሎች የተጋለጡ የነርቭ እጥፋት በእርግጥ CNCC እንደያዙ አረጋግጧል።በተጨማሪም፣ AP2A እና SOX10 ቀደምት ፍልሰት የኤን.ሲ.ሲ ምልክቶች በመሆናቸው፣ እነዚህ ህዋሶች በE9.5 ሊከፋፈሉ የማይችሉ ድህረ-ስደት CNCC መሆናቸውን አወንታዊ ቀለም ያሳያል።
የኛ መረጃ እንደሚያመለክተው የኤጄ ሞለኪውላዊ ደንብ በ SPECC1L በPI3K-AKT ምልክት መካከለኛ ነው።የ AKT ምልክት በ SPECC1L ጉድለት ሴሎች እና ቲሹዎች ውስጥ ይቀንሳል።በFantauzzo et al ግኝቶች.በ craniofacial morphogenesis ውስጥ ለ PI3K-AKT ምልክት ቀጥተኛ ሚና ይደግፉ።(2014) እንደሚያሳየው በPDGFRα ላይ የተመሰረተ PI3K-AKT ምልክት ማግበር አለመኖሩ ወደ ክላፍ ፕላት ፊኖታይፕ ይመራል።እንዲሁም የ PI3K-AKT መንገዱን መከልከል በ U2OS ሴሎች ውስጥ የ AJ እና የሕዋስ ቅርፅን ለመለወጥ በቂ መሆኑን እናሳያለን።ከግኝቶቻችን ጋር በሚስማማ መልኩ ቃየን እና ሌሎች.37 እንደሚያሳየው የ PI3K α110 ንኡስ ክፍል በ endothelial ሕዋሳት ውስጥ ማሽቆልቆሉ በፔሪሴሉላር β-catenin ማቅለሚያ ላይ ተመሳሳይ ጭማሪ እንደሚያመጣ ያሳያል, ይህም የ "ግንኙነት ኢንዴክስ" መጨመር ነው.ነገር ግን፣ የአክቲን ፋይሎቻቸው በከፍተኛ ደረጃ ተደራጅተው በሚገኙ endothelial ሴሎች ውስጥ፣ የ PI3K-AKT መንገዱን መጨቆኑ የላላ የሕዋስ ቅርፅን ያስከትላል።በተቃራኒው፣ SPECC1L-kd U2OS ሕዋሳት የተራዘመ የሕዋስ ቅርጽ አሳይተዋል።ይህ ልዩነት የሕዋስ ዓይነት የተለየ ሊሆን ይችላል።የ PI3K-AKT ምልክትን ማፈን የአክቲን ሳይቶስክሌቶንን በቋሚነት ይነካል ፣ በሴል ቅርፅ ላይ ያለው ተፅእኖ የሚወሰነው በማዕከላዊ የአክቲን ፋይበር ውፍረት እና አደረጃጀት ለውጦች ምክንያት በተከሰቱ የውጥረት ለውጦች ነው።በU2OS ሕዋሳት ውስጥ፣ የSPECC1L ጉድለት ያለበት የኤጄ ለውጥ እና ማገገሚያ እንደ ምልክት የሕዋስ ቅርጽ ለውጦችን ብቻ ተጠቀምን።በማጠቃለያው፣ በ SPECC1L እጥረት ውስጥ የ AKT መንገድን መከልከል የ AJ መረጋጋትን እንደሚጨምር እና በ CNCC ውስጥ መበላሸትን እንደሚቀንስ እንገምታለን።
የሚገርመው ነገር፣ SPECC1L በማይኖርበት ጊዜ የፓን-AKT መጠን በብልት ውስጥ እና በ vivo በተጨማሪ ፎስፈረስላይትድ 473-AKT መጠን ቀንሷል፣ ይህም የ PI3K-AKT ምልክትን በ AKT ፕሮቲን መረጋጋት ወይም የመቀያየር ደረጃ ላይ እንደሚገኝ ይጠቁማል።የ SPECC1L እና MID1 ጂኖች, ሁለቱም ከኦፒትዝ / ጂቢቢቢ ሲንድሮም ጋር የተያያዙ, ማይክሮቱቡልስ 18,22 ን የሚያረጋጉ ፕሮቲኖችን ያመለክታሉ.SPECC1L እና MID1 ማይክሮቱቡል ማረጋጊያን የሚያስተካክሉበት ዘዴ ሙሉ በሙሉ አልተረዳም።በ SPECC1L ሁኔታ, ይህ ማረጋጊያ የተሻሻለ ማይክሮቱቡል 18 ንዑስ ክፍልን ያካትታል.እንደ AKT ያሉ ሌሎች ፕሮቲኖችን ለማረጋጋት SPECC1L ተመሳሳይ ዘዴን ሊጠቀም ይችላል።በኤኬቲ ፕሮቲን ውስጥ የሚገኘው የላይሲን ቅሪቶች አሲታይላይዜሽን የሜምቦል አካባቢን እና ፎስፈረስላይዜሽን38ን መቀነስ እንደሚያመጣ ታይቷል።በተጨማሪም የ K63 ሰንሰለት በ AKT ላይ ባለው ተመሳሳይ የላይሲን ቅሪት ላይ በየቦታው እንዲሰራጭ እና እንዲነቃቁ39,40 ያስፈልጋል።ከ SPECC1L ፕሮቲኖች ጋር መስተጋብር ከሚፈጥሩ በርካታ ምክንያቶች መካከል በተለያዩ ከፍተኛ የፍሰት እርሾ ሁለት-ድብልቅ ስክሪኖች፣ አራት - CCDC841፣ ECM2942፣ APC እና UBE2I43 - በየቦታው ወይም በሱሞይላይዜሽን በኩል በፕሮቲን መለዋወጥ ወይም መረጋጋት ላይ ተሳትፈዋል።SPECC1L በድህረ-ትርጉም ማሻሻያ የ AKT ላይሲን ቅሪቶች ላይ ሊሳተፍ ይችላል፣ ይህም የ AKT መረጋጋትን ይነካል።ነገር ግን፣ የ SPECC1L ወሳኝ ሚና በ AKT ፕሮቲን አካባቢያዊነት እና መረጋጋት ውስጥ ለመብራራት ይቀራል።
Vivo ውስጥ በ SPECC1L አገላለጽ ላይ ያሉ ከባድ ጉድለቶች የኤጄ ማርከር ማቅለሚያ እና ጉድለት ያለበት የ CNCC ተደራቢ፣ እንዲሁም አፖፕቶሲስ እና ቀደምት የፅንስ ገዳይነት መጨመር አስከትለዋል።የቀደሙት ዘገባዎች እንደሚያሳዩት የአፖፕቶሲስ መጠን መጨመር ያላቸው የመዳፊት ሙታንቶች ከነርቭ ቱቦ ጉድለቶች 44,45,46,47 እና craniofacial ጉድለቶች48 ጋር የተቆራኙ ናቸው.በነርቭ እጥፋት ወይም በፍራንነክስ ቅስቶች ውስጥ ከመጠን በላይ የሴል ሞት መሞቱ ለትክክለኛው ሞሮፊኔቲክ እንቅስቃሴ 48,49,50 የሚያስፈልጉትን በቂ ያልሆነ የሴሎች ብዛት ሊያስከትል እንደሚችል ተጠቁሟል.በአንጻሩ፣ የእኛ የSPECC1L ጉድለት ያለባቸው የሕዋስ መስመሮቻቸው በመጠኑ የተቀነሱ የSPECC1L አገላለጽ የኤጄ ለውጦችን ብቻ ነው የሚያሳየው የሕዋስ ሞት መጨመር ማስረጃ የለም።ነገር ግን በእነዚህ የKd ህዋሶች ውስጥ ያለው የPI3K-AKT መንገድ ኬሚካላዊ መከልከል አፖፕቶሲስን አስከትሏል።ስለዚህ የ SPECC1L አገላለጽ ወይም ተግባር መጠነኛ መቀነስ የሕዋስ ህልውናን ያረጋግጣል።ይህ በሴንት ውስጥ ከመታሰር የሚያመልጡትን ብርቅዬ Specc11 የሚውቴሽን ሽሎች ከተመለከተው ምልከታ ጋር የሚስማማ ነው።E9.5-ምናልባት የጂን ቀረጻ ቅልጥፍናን በመቀነሱ ምክንያት - የነርቭ ቧንቧዎቻቸውን መዝጋት እና ከጊዜ በኋላ በእድገት ማቆም ይችላሉ, ብዙውን ጊዜ በክራንዮፋሻል ጉድለቶች (ምስል S3).በተጨማሪም ከዚህ ጋር የሚስማማው አልፎ አልፎ ሄትሮዚጎስ ስፔክ1ል ሽሎች በክራንዮፊሻል እክሎች—ምናልባት የጂን ቀረጻ ቅልጥፍናን በመጨመሩ እና እንዲሁም ከሁለቱ SPECC1L orthologues (specc1lb) አንዱ ዘግይቶ የሚመጡ የፅንስ ፌኖታይፖችን የሚያጣበት የዚብራፊሽ ግኝት ነው። የታችኛው መንገጭላ እና የሁለትዮሽ ስንጥቅ51.ስለዚህ, heterozygous SPECC1L በሰው ሕመምተኞች ላይ የሚከሰቱ የተግባር ማጣት ለውጦች በ SPECC1L ተግባር ላይ በ craniofacial morphogenesis ውስጥ አነስተኛ እክሎችን ሊያስከትሉ ይችላሉ, ይህም የኦሮፋሻል ስንጥቆችን ለማብራራት በቂ ነው.በSPECC1L ላይ የተመሰረተ የኢንተርሴሉላር እውቂያዎች ደንብ በፓላቶጄኔሲስ እና በpharyngeal ቅስቶች ውህደት ውስጥ ሚና ሊጫወት ይችላል።የ SPECC1L ተግባር ተጨማሪ ጥናቶች በ CNCC ውስጥ የነርቭ ቱቦ መዘጋት በኒውሮኤፒተልየል ሴል ሞቲሊቲ እና በክራንዮፋሲያል ሞርሞጅጄኔሲስ ውስጥ ጊዜያዊ የኢንተርሴሉላር ንክኪዎችን ሚና ለማብራራት ይረዳል።
U2OS osteosarcoma ቁጥጥር እና SPECC1L-kd ሕዋሳት ቀደም ሲል ተገልጸዋል (Saadi et al., 2011).ፀረ እንግዳ አካላት ከSPECC1L በፊትም ተለይተዋል (Saadi et al., 2011)።ፀረ-β-ካቴኒን ፀረ እንግዳ አካላት (ጥንቸል፣ 1:1000፣ ሳንታ ክሩዝ፣ ዳላስ፣ ቲኤክስ) (አይጥ፣ 1:1000፣ የሕዋስ ምልክት ማድረጊያ ቴክኖሎጂ፣ ዳንቨርስ፣ ኤምኤ)፣ myosin IIb (1:1000፣ ሲግማ-አልድሪች፣ ሴንት. )፣ MO))፣ ኢ-ካድሪን (1፡1000፣ አብካም፣ ካምብሪጅ፣ ኤምኤ)፣ AP2A (1፡1000፣ ኖውስ ባዮሎጂካል፣ ሊትልተን፣ ኮሎ.)፣ SOX10 (1፡1000፤ 1000፤ አቪቫ ሲስተምስ ባዮሎጂ፣ ሳንዲያጎ) ካሊፎርኒያ)፣ ዲኤልኤክስ2 (1፡1000፣ አብካም፣ ካምብሪጅ፣ ኤም.ኤ)፣ ፎስፎ-ሰር473-ኤኬቲ (1፡1000፣ የሕዋስ ምልክት ማድረጊያ ቴክኖሎጂ፣ ዳንቨርስ፣ ኤምኤ)፣ ፓን-ኤኬቲ (1፡1000፣ ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ፣ ዋልተም፣ ኤምኤ) )፣ KI67 (1፡1000፣ የሕዋስ ሲግናልንግ ቴክኖሎጂ፣ ዳንቨርስ፣ ኤምኤ)፣ የተሰነጠቀ ሰበር 3 (1፡1000፣ የሕዋስ ሲግናልንግ ቴክኖሎጂ፣ ዳንቨርስ፣ ኤምኤ) እና β-actin (1፡2500፣ ሲግማ-አልድሪች፣ ሴንት. MO) እንደተገለጸው ጥቅም ላይ ውሏል..የአክቲን ክሮች በአክቲ-ስታይን ሮዳሚን ፋሎይድ (ሳይቶስኬልተን፣ ዴንቨር፣ ኮሎራዶ) ተበክለዋል።
U2OS ቁጥጥር ሴሎች እና SPECC1L-kd ሕዋሳት መደበኛ ከፍተኛ ግሉኮስ DMEM 10% fetal bovine serum (ላይፍ ቴክኖሎጂስ, Carlsbad, CA) ጋር ተጨምሯል ነበር.ለኤጄ ለውጦች፣ 2 x 105 ሴሎች በ0.1% porcine gelatin (ሲግማ-አልድሪች፣ ሴንት ሉዊስ፣ MO) ታክመው በመስታወቱ ላይ ተዘርረዋል እና በሴል ቅርፅ ላይ ለውጥ ታይተዋል።ህዋሶች የተሰበሰቡት በተለያየ ጊዜ በተጠቀሰው ጊዜ ነው፡ ከተዘሩ ከ4 ሰአታት በኋላ (t = 1)፣ ከተዘሩ ከ24 ሰአታት በኋላ (t = 2)፣ የሕዋስ ቅርፅ ለውጥ ሳይደረግ ውህደት (t = 3)፣ የሕዋስ ቅርፅ ለውጥ (t = 4) የሕዋስ ቅርጽ ከተቀየረ ከ 24 ሰአታት በኋላ (t = 5) እና ከ 48 ሰአታት በኋላ የሕዋስ ቅርፅ ለውጥ (t = 6) (ምስል 1, 2, 3).የPI3K-AKT መንገዱን ለማስተካከል ሴሎች በተጠቆሙት ውህዶች ከPI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ወይም SC-79 activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota) ጋር ተዳብረዋል።ኬሚካሎችን የያዘው መካከለኛ በየቀኑ ተለውጧል.
የፍሬም-በ-ፍሬም ቅጂዎች በቀጥታ ቁጥጥር እና በKD ሴሎች ላይ በመደበኛ የባህል ሁኔታዎች ውስጥ ተሰርተዋል፣ እና የደረጃ ንፅፅር ምስሎች በየ10 ደቂቃው ለ7 ቀናት ተሰብስበዋል።ምስሎች የተገኙት በኮምፒዩተር በሚቆጣጠረው ላይካ ዲኤም አይአርቢ የተገለበጠ ማይክሮስኮፕ በሜካኒካዊ ደረጃ እና 10 × N-PLAN ዓላማ ከQImaging Retiga-SRV ካሜራ ጋር የተገናኘ ነው።በምስል ወቅት, የሕዋስ ባህሎች በ 37 ° ሴ እርጥበት ባለው አየር ውስጥ ከ 5% CO2 ጋር ይጠበቃሉ.
ሁለት የጂን ወጥመድ ኢኤስ ሴል መስመሮች DTM096 እና RRH048 ከክልላዊ ሙታንት መዳፊት ሪሶርስ ሴንተር (ዩሲ ዴቪስ፣ ሲኤ) የ Specc11 ጉድለት ያለባቸውን የመዳፊት መስመሮችን፣ Specc1lgtDTM096 እና Specc1lgtRRH046 የተሰየሙትን ለማምረት ጥቅም ላይ ውለዋል።በአጭሩ፣ 129/REJ ES ሕዋሳት በC57BL6 blastocysts ውስጥ ገብተዋል።የተገኘው ቺሜሪክ ወንድ አይጥ ከሴቶች C57BL6 አይጦች ጋር በአጎውቲ ኮት ቀለም ያላቸውን ዘሮች ለመለየት ተዘጋጅቷል።የጂን ወጥመድ ቬክተር ማስገቢያዎች መኖራቸው heterozygotes ለመለየት ጥቅም ላይ ውሏል.አይጦች በ129/REJ፤C57BL6 ድብልቅ ዳራ ላይ ተቀምጠዋል።የጄኔቲክ ወጥመድ ቬክተር የገባበት ቦታ በ RT-PCR, በጂኖም ቅደም ተከተል እና በጄኔቲክ ማሟያ (ተጨማሪ ምስል 1) ተረጋግጧል.ድርብ heterozygous Specc1lGT አይጦችን የCNCC የዘር ሐረግ ለመከታተል ROSAmTmG (#007576) እና Wnt1-Cre (#003829) አይጥ (ጃክሰን ላቦራቶሪ፣ ባር ሃርቦር፣ ME) ROSAmTmG እና Wnt1-Cre allele in Specem1.ሁሉም በአይጦች ላይ የተደረጉ ሙከራዎች የተከናወኑት በካንሳስ የህክምና ማዕከል ተቋማዊ የእንስሳት እንክብካቤ እና አጠቃቀም ኮሚቴ በተፈቀደላቸው ፕሮቶኮሎች መሰረት ነው።
ፅንሶች በ (1% ፎርማለዳይድ, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 60 ደቂቃዎች ተስተካክለዋል.በኤክስ-ጋል ማቅለሚያ መፍትሄ (5 mM ፖታስየም ፌሪሲያዳይድ, 5 ሚሜ ፖታስየም ፌሮሲያናይድ, 2 ሚሜ ኤም ኤም ጂሲል2, 0.01% ሶዲየም ዲኦክሲኮሌት, 0.02% NP-40, 1 mg / ml X-gal) ከተስተካከለ በኋላ የእድፍ እድገት በ 37 ° ሴ. .ከ1-6 ሰአታት ውስጥ ° ሴ.ፅንሶች በ 4% PFA ውስጥ ድህረ-ቋሚ እና ምስላዊ ናቸው.
ለምዕራቡ መጥፋት፣ ህዋሶች በፓሲቭ lysis ቋት (Promega፣ Fitchburg፣ WI) በ HALT ፕሮቲን መከላከያዎች (ሲግማ-አልድሪች፣ ሴንት ሉዊስ፣ MO) ድብልቅ ተጨምረዋል።Lysates በ 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX ተዘጋጅተው የተሰሩ ጄልስ (ባዮ-ራድ፣ ሄርኩለስ፣ ሲኤ) እና ወደ Immobilon PVDF membranes (EMD Millipore, Billerica, MA) ተላልፈዋል።ሽፋኖቹ በ 5% ወተት ውስጥ በፒቢኤስ ውስጥ 0.1% Tween በያዘው ታግደዋል.ፀረ እንግዳ አካላት በአንድ ሌሊት በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ወይም ለአንድ ሰዓት በክፍል ሙቀት ውስጥ ተተክለዋል.Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) ለምልክት ማመንጨት ስራ ላይ ውሏል።ለክትባት መከላከያ፣ ፅንሶች በአንድ ሌሊት በ4% PFA/PBS ውስጥ ተስተካክለው እና ከርሶ ተጠብቀዋል።የቲሹ ክሪሴክሽን በፒቢኤስ ውስጥ 1% መደበኛ የፍየል ሴረም (ቴርሞ ሳይንቲፊክ ፣ ዋልታም ፣ ኤምኤ) እና 0.1% ትሪቶን ኤክስ-100 (ሲግማ-አልድሪች ፣ ሴንት ሉዊስ ፣ MO) የያዙ እና ከዚያም በ 4 ° ሴ ውስጥ በማቀፊያ ውስጥ ታግደዋል ። ለሊት.በፀረ-አንቲባዮቲክ እና በፍሎረሰንት ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት (1: 1000) ለ 1 ሰዓት በ 4 ° ሴ.ባለቀለም ክፍሎች በፕሮሎንግ ወርቅ መካከለኛ (ቴርሞ ሳይንቲፊክ ፣ ዋልተም ኤምኤ) ውስጥ ተቀምጠዋል እና ጠፍጣፋ ምስሎች በሌካ TCS SPE ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ ተጠቅመዋል።እያንዳንዱ የበሽታ መከላከያ ዘዴ ቢያንስ ሁለት የሚውቴሽን ሽሎች ላይ በሦስት ገለልተኛ ሙከራዎች ተከናውኗል።ተወካይ ሙከራ ታይቷል።
ሴሎች በተሻሻለው RIPA ቋት (20 ሚሜ ትሪ-ኤችኤልኤል፣ ፒኤች 8.0፣ 1% NP-40፣ 130 ሚሜ ናሲል፣ 10% glycerol፣ 2 mM EDTA እና HALT ፕሮቲንቢንሰር (Sigma-Aldrich፣ St. Louis, MO) ባጭሩ፣ ሊዛት በፕሮቲን ጂ መግነጢሳዊ ዶቃዎች (Life Technologies፣ Carlsbad፣ CA) ቀድመው ተጠርዘዋል ከዚያም በአንድ ሌሊት በ 4° ሴ.ከፀረ-SPECC1L ወይም IgG ፕሮቲን ጂ ፕሮቲን ዶቃዎች ጋር SPECC1L ለማውጣት ጥቅም ላይ ውለዋል እና ምዕራባውያን መጥፋትም ፀረ-ተቀባይነትን በመጠቀም ተከናውኗል። -β-catenin antibody ከላይ የተገለጸው የትብብር-IP ሙከራዎች የአራት ገለልተኛ ሙከራዎችን ይወክላሉ።
ቋሚ የሰለጠኑ ሴሎች ወይም የመዳፊት ፅንስ ቲሹዎች በካንሳስ ሜዲካል ሴንተር ዩኒቨርሲቲ ለኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ ማእከል ተሰጥተዋል።በአጭሩ፣ ናሙናዎች በEMbed 812 resin (ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒ ሳይንስ፣ ፎርት ዋሽንግተን ፒኤ)፣ በአንድ ሌሊት ፖሊሜራይዝድ በ60 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ እና በ80 nm የተከፋፈሉ በሊካ UC7 አልትራሚክሮቶም የአልማዝ ምላጭ የተገጠመላቸው ናቸው።ክፍሎች በ JEOL JEM-1400 ማስተላለፊያ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ 100 ኪሎ ቮልት ላብ6 ሽጉጥ በመጠቀም ታይተዋል።
ይህን ጽሑፍ እንዴት እንደሚጠቅስ፡ ዊልሰን፣ ኤንአር እና ሌሎችም።የ SPECC1L እጥረት የተቆራረጡ መገጣጠሚያዎች መረጋጋት እና የራስ ቅል ነርቭ ክራስት ሴሎች እንዲቀንስ ያደርጋል.ሳይንስ.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
ሴንት-ጄን, ጄ.-ፒ.የነርቭ ግርዶሽ ማነሳሳት እና ልዩነት.(ስፕሪንገር ሳይንስ + ቢዝነስ ሚዲያ፤ ላንድስ ባዮሳይንስ/Eurekah.com፣ 2006)።
Cordero, DR እና ሌሎች.በእንቅስቃሴ ላይ የራስ ቅል የነርቭ ሴል ሴሎች: በ craniofacial እድገት ውስጥ ያላቸው ሚና.የአሜሪካ የሕክምና ጄኔቲክስ ጆርናል.ክፍል A 155A, 270-279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
ቦላንድ, RP Neurocristopathia: ከ 20 ዓመታት በላይ እድገቱ እና እድገቱ.የሕፃናት ሐኪም.ፓቶሎጂ.ላቦራቶሪ.መድሃኒት.17፣ 1–25 (1997)።
Mangold E., Ludwig KU እና Noten MM Breakthrough በኦሮፋሻል ስንጥቅ ዘረመል።በሞለኪውላር ሕክምና ውስጥ ያሉ አዝማሚያዎች 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
ሚኒ፣ ኤም. እና ራይሊ፣ ኤፍኤም ሞለኪውላዊ ዘዴዎች የራስ ቅል የነርቭ ሴል ፍልሰት እና በ craniofacial እድገት ወቅት ስርዓተ-ጥለት።ልማት 137, 2605-2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon፣ MJ፣ Maraazita፣ ML፣ Bety፣ TH እና Murray፣ JK Cleft lip and palate፡ የጄኔቲክ እና የአካባቢ ተጽእኖዎችን መረዳት።የተፈጥሮ አስተያየት.ጀነቲክስ 12፣167–178፣ doi፡ 10.1038/nrg2933 (2011)።
ኢንግራም, ሲአር እና ሌሎች.በ interferon-regulating factor-6 (Irf6) ጉድለት የሌላቸው አይጦች ውስጥ የቆዳ፣ እጅና እግር እና ክራንዮፋሻል ክልል ያልተለመደ ሞርጀኔሲስ።ብሄራዊ ገነት.38፣ 1335–1340፣ ዶኢ፡ 10.1038/ng1903 (2006)።
Peyrard-Janvid, M. et al.በ GRHL3 ውስጥ ያሉት ዋና ሚውቴሽን የቫን ደር ዋርድ ሲንድሮም (ቫን ደር ዋርድ ሲንድሮም) ያስከትላሉ እና የአፍ ውስጥ ፔሪደርም እድገትን ያበላሻሉ።Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014)
ሃሪስ፣ ኤምጄ እና ጁሪሎፍ፣ ዲኤም በነርቭ ቱቦ መዘጋት ላይ ጉድለት ያለባቸውን የመዳፊት ሚውቴሽን ዝርዝር ያዘምኑ እና ወደ የነርቭ ቱቦ መዘጋት የተሟላ የጄኔቲክ ግንዛቤ እድገት።የልደት ጉድለቶች ምርመራ.ክፍል A, ክሊኒካል እና ሞለኪውላር ቴራቶሎጂ 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha ምልክት ማድረጊያ በ p53-ጥገኛ ውስጠ-ህዋስ መንገድ በኩል በአጥንት እድገት ውስጥ መዳንን እና መስፋፋትን ይቆጣጠራል.የጂን ልማት 28, 1005-1017, doi: 10.1101 / gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND እና Murdoch, JN Disheveled: ከነርቭ ቱቦ መዘጋት ጋር የተቆራኘ መስፋፋት ግንኙነት።በኒውሮሎጂ ውስጥ ያሉ አዝማሚያዎች.26፣ 453–455፣ ዶኢ፡ 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003)።