347 አይዝጌ ብረት የተጠቀለለ ቱቦ ኬሚካላዊ አካል ፣የተሻገረ የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (CLMS) በመጠቀም ልብ ወለድ ኢንተርፌሮን ምላሽ ሰጭ የሰው ሌኩኮይት አንቲጂን-ኤ (HLA-A) ቻፔሮን ፕሮቲኖችን መለየት።

Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ ያለው የአሳሽ ስሪት እየተጠቀሙ ነው።ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)።በተጨማሪም, ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ, ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን.
በእያንዳንዱ ስላይድ ሶስት መጣጥፎችን የሚያሳዩ ተንሸራታቾች።በተንሸራታቾች ውስጥ ለመንቀሳቀስ የኋላ እና ቀጣይ ቁልፎችን ይጠቀሙ ፣ ወይም በእያንዳንዱ ስላይድ ውስጥ ለመንቀሳቀስ በመጨረሻው ላይ ያሉትን የስላይድ መቆጣጠሪያ ቁልፎችን ይጠቀሙ።

የምርት ማብራሪያ

አይዝጌ ብረት 347L ጥቅል ቱቦዎች፣ የአረብ ብረት ደረጃ፡ SS347L

የኢንተርፌሮን ምልክት ማድረጊያ ስርዓት ለአካባቢው የተለያዩ በሽታ አምጪ እና ውስጣዊ የፓቶሎጂ ምልክቶች ጠንካራ የሳይቶኪን ምላሽ ይሰጣል ፣ በዚህም ምክንያት የ interferon-inducible ፕሮቲኖች ንዑስ ክፍሎች እንዲፈጠሩ ያደርጋል።በኢንተርፌሮን በሚፈጠሩ ፕሮቲኖች ውስጥ አዲስ የፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብርን ለመለየት በDSS-mediated cross-link mass spectrometry (CLMS) ተተግብረናል።ከተጠበቀው ኢንተርፌሮን-ኢንዳክቲቭ ፕሮቲኖች በተጨማሪ፣ እንደ MX1፣ USP18፣ OAS3 እና STAT1 ያሉ ቀኖናዊ ኢንተርፌሮን-ኢንዳክቲቭ ፕሮቲኖችን ልብ ወለድ ኢንተርሞለኩላር እና ውስጠ-ሞለኪውላር ተሻጋሪ ፕሮቲን ለይተናል።በHLA-A ፕሮቲኖች (H2BFS-HLA-A-HMGA1) የተቀናጀ የኢንተርፌሮን ፕሮቲን ኔትወርኮች የጋራ መከላከያ እና ሞለኪውላዊ ተለዋዋጭ ሞዴሊንግ በመጠቀም ተጨማሪ ጥናታቸውን በማረጋገጥ ላይ አተኩረን ነበር።የፕሮቲን ኮምፕሌክስ ኮንፎርሜሽን ተለዋዋጭ ሞዴሊንግ በ CLMS ግኝቶች ውስጥ ተለይተው የሚታወቁትን መስተጋብር የሚያንፀባርቁ በርካታ የመስተጋብር ቦታዎችን አሳይቷል።አንድ ላይ፣ በኢንተርፌሮን የተከሰቱ አዳዲስ የምልክት መስጫ ውስብስቦችን ለመለየት የ CLMS የሙከራ ጥናት አቅርበናል፣ እና የ CLMS ሰፊ አጠቃቀምን በጉጉት እንጠባበቃለን ዕጢው ማይክሮ ኤንቨሮንመንት ውስጥ አዲስ የፕሮቲን መስተጋብር ለውጦችን ለመለየት።
የሚለምደዉ የበሽታ መቋቋም ምላሽ ከመጀመሩ በፊት የአስተናጋጁ ውስጣዊ መከላከያ ስርዓት ኢንተርፌሮን (IFNs) በተባሉ ሚስጥራዊ የአልፋ-ሄሊካል ሳይቶኪኖች ቤተሰብ አማላጅ የሆነ ፀረ-ተሕዋስያን ምላሽ ይሰጣል።የ I IFN አይነት IFNα እና IFNβ የተንቀሳቃሽ ስልክ ምላሾችን ያንቀሳቅሳሉ፣ ይህም ፀረ-ቫይረስ፣ ፕሮፖፕቶቲክ፣ ፕሮብሊማቲክ እና ፀረ-ፕሮሊፌራቲቭ ግዛቶችን ይጨምራል።በሰዎች ውስጥ, 13 የ IFNα ንዑስ ዓይነቶች ይታወቃሉ, ሁሉም በክሮሞሶም 91 ላይ ይሰበሰባሉ. በሚያስደንቅ ሁኔታ, IFNα2 ብቻ ለክሊኒካዊ አገልግሎት ጥናት ተደርጓል.በቅርቡ፣ በሌሎች የIFNα ንዑስ ዓይነቶች ላይ ምርምር ለማድረግ ልዩ ትኩረት ተሰጥቷል።በቅርብ የተደረገ ጥናት እንደሚያሳየው IFNα14 ከቀኖናዊው IFNα2 ንዑስ ዓይነት ጋር ሲነጻጸር HBV2 እና HIV-13,4 ማባዛትን በመገደብ ረገድ በጣም ውጤታማ ከሆኑት isoforms አንዱ ነው።
ገቢር የተደረገው ዓይነት I ኢንተርፌሮን ተቀባይ ኮምፕሌክስ (IFNAR1 እና IFNAR2) በ Janus kinases TYK2 እና JAK15,6 መካከለኛ የሆነ የሲግናል ማስተላለፊያ ካስኬድ እንደሚያስነሳ ተረጋግጧል።እነዚህ Janus kinases phosphorylate ሲግናል ተርጓሚዎች እና ግልባጭ ፕሮቲን activators (STAT1 እና STAT2) ታይሮሲን ቀሪዎች ላይ SH2 ጎራ-መካከለኛ heterodimerization6 ለመጀመር.በመቀጠል፣ IRF9 STAT heterodimersን በማሰር የIFN-stimulated factor 3 ጂን (ISGF3) trimeric ውስብስብ ወደ ኒውክሊየስ የሚሸጋገር እና ከ2000 በላይ ኢንተርፌሮን የሚያነቃቁ ጂኖች (ISGs) 5,6,7,8 እንዲገለበጥ ያደርጋል።
ISGs በተፈጥሮ በሽታ የመከላከል ስርዓት ውስጥ በተለይም ለቫይረስ ጥቃት ምላሽ ለመስጠት የጀርባ አጥንት ይመሰርታሉ።የቫይረስ ኢንፌክሽንን ለመከላከል የመጀመሪያው መስመር እንደመሆኑ መጠን ሴሉላር ፕሮቲኖችን ከብዙ ባዮሎጂያዊ እንቅስቃሴዎች ጋር ሰፊ መስተጋብርን በፍጥነት ያሰማራሉ።እነዚህ ፕሮቲኖች የስርዓተ-ጥለት ማወቂያ ተቀባይ፣ ምልክት ሰጪ ሞለኪውሎች፣ የጽሑፍ ግልባጭ ሁኔታዎች፣ እና ቀጥተኛ የፀረ-ቫይረስ ተግባራት ያላቸው ፕሮቲኖች፣ እንዲሁም የበሽታ መቋቋም ምላሾችን አሉታዊ ተቆጣጣሪዎች ያካትታሉ9።በISG እንቅስቃሴ ላይ ያለው አብዛኛው መረጃ የሚመጣው ከመጠን በላይ የመጨመሪያ ስክሪን10፣11 ወይም የጂን ዝምታ ቴክኒኮችን (siRNA፣ RNAi እና CRISPR)12,13 በመጠቀም የግለሰብ ISGዎች የሚገለጡበት ወይም የሚከለከሉበት እና እንቅስቃሴያቸው በተለያዩ ቫይረሶች ላይ የሚሞከር ነው።ምንም እንኳን እነዚህ ጥናቶች የግለሰብ ISG ዎች ፀረ-ቫይረስ ባህሪያትን ቢወስኑም፣ የእያንዳንዱ ISG ሞለኪውላዊ ዘዴዎች ብዙም ያልታወቁ ናቸው።ሙሉ እንቅስቃሴን ለማረጋገጥ ብዙ ፕሮቲኖች ከአንድ ወይም ከዛ በላይ ሳይቶኪኖች ጋር መስተጋብር መፍጠር በአጠቃላይ ተቀባይነት አለው፣ ስለዚህ ISGs በቀጥታ ይገናኛሉ ወይም ግንኙነታቸው በሴሉላር ፕሮቲኖች መካከለኛ ነው።ለምሳሌ፣ በቅርብ የተደረገ የፎቶክሮስሊንክድ ፕሮቲዮሚክስ ጥናት ATPase VCP/p97 እንደ ዋና የ IFITM3 መስተጋብር አጋር፣ መከልከሉ የሊሶሶም መደርደር፣ ማዞር እና የ IFITM3 ን ከቫይረስ ቅንጣቶች 14 ጋር ወደ ጉድለት ያመራል።የበሽታ መከላከልን በመጠቀም፣ VAPA፣ ከቬሴክል ጋር የተገናኘ ፕሮቲን፣ ከ IFITM1/2/3 ጋር እንደ መስተጋብር አጋር በመሆን ኮሌስትሮል-መካከለኛ የሆነ የቫይረስ ብስለትን ለይተናል፣ ይህ ደግሞ እርሾ ሁለት-ድብልቅ ስርዓትን በመጠቀም በሌላ ጥናት ተረጋግጧል።ሳይንሳዊ ድጋፍ 15, 16 .
ኢንፌክሽኑን እና አደገኛ ለውጦችን በመከላከል ላይ የተሳተፈ መሰረታዊ ባዮሎጂያዊ ሂደት በዋና ሂስቶኮፓቲቲቲ ኮምፕሌክስ (MHC) ሞለኪውሎች የሚስተናገደው አንቲጂን አቀራረብ ነው።Peptides (8-12 አሚኖ አሲዶች ረጅም) ከተሰነጣጠቁ, ያለጊዜው የተቋረጡ ወይም የተሳሳቱ ፕሮቲኖች ወደ MHC-I heterodimer (MHC-I ከባድ እና ቀላል ሰንሰለቶች ያሉት, β-2-microglobulin; β2M) 17,18 ይጫናሉ.የተገኙት የተረጋጋ MHC-I trimers ወደ ሴል ወለል ይጓጓዛሉ, ወደ ሴሉላር peptides ወደ ሲዲ8+ ቲ ሴሎች (ሳይቶቶክሲክ ቲ ሴሎች) 17.ቲ ሴሎች እነዚህን በሽታ አምጪ ተህዋሲያን እና ዕጢ-ተኮር አንቲጂንን የሚሸከሙ ሴሎችን ያውቁ እና ያጠፏቸዋል።በዚህም ምክንያት በሽታ አምጪ ተህዋሲያን እና እጢ ህዋሶች የበሽታ መከላከያ ክትትልን ለማስወገድ ብዙውን ጊዜ አንቲጅንን የማቅረቡ ሂደትን ያጨናሉ።በተጨማሪም, MHC-I ከ40-90% የሰዎች እጢዎች ላይ ቁጥጥር ይደረግበታል እና ብዙ ጊዜ ከደካማ ትንበያ19 ጋር ይዛመዳል.
በሽታ አምጪ ተህዋስያንን ምላሽ ለመስጠት የሚሳተፉ ጂኖች በፍጥነት በእረፍት እና በነቃ የጽሁፍ ግልባጭ መካከል መቀያየር አለባቸው።ስለዚህ, በርካታ ሴሉላር ፕሮቲኖች ለአጭር ጊዜ ከፍተኛ የ IFN ፍላጎት ምላሽ እንዲሰጡ ይገመታል, ይህም የፕሮሞተር chromatin 20,21 ማሻሻያ እና ማሻሻልን ጨምሮ.አብዛኛዎቹ ጥናቶች ያተኮሩት በ IFN ፊት የግለሰብ ISG ፕሮቲን አጋሮችን በመለየት ላይ ነው።በሞዴል ሴል ሲስተም ውስጥ ያሉ በርካታ ፕሮቲዮሚክ እና ትራንስክሪፕቶሚክ ጥናቶች የ IFN በሴሉላር ገጽታ ላይ ያለውን ተጽእኖ አብራርተዋል።ነገር ግን፣ በኢንተርፌሮን ስለሚነሳሳው ተለዋዋጭነት ግንዛቤ እያደገ ቢመጣም፣ ስለ ISGዎች ተሳትፎ አሁንም የምናውቀው ነገር የለም።የኢንተርፌሮን ምልክትን ውስብስብነት እና ጊዜ-ጥገኛ ተለዋዋጭነት ግምት ውስጥ በማስገባት ሁለት ጥያቄዎች ይነሳሉ፡ (i) በፍጥነት ምልክት ላይ የተካተቱትን የባለብዙ ፕሮቲን ውህዶች ማረጋጋት እና ማጥመድ ይቻላልን እና (ii) እነዚህ መስተጋብሮች ወደ 3D ቦታ ሊቀረጹ ይችላሉ?
እነዚህን ችግሮች ለመፍታት፣ የIFNα-የሚፈጠር የፕሮቲን መስተጋብር አውታር እና ተለዋዋጭ ሁኔታዎችን ለማጥናት የዲሱሲኒሚሚድ ንዑስ-መካከለኛ የኬሚካል መስቀል-ማገናኘት (DSS) ከ mass spectrometry (CLMS) ጋር ተግብረናል።DSS በፕሮቲን እና/ወይም ፕሮቲን ውስብስብ ውስብስብ ቀሪዎች መካከል የጋራ ትስስርን ይጨምራል።የሚቀጥለው የኤምኤስ ትንተና በአንድ የተወሰነ ፕሮቲን ውስጥ ያሉ የክልሎችን የቦታ ቅርበት የሚያንፀባርቁ ልዩ የማቋረጫ ጣቢያዎችን ያሳያል፣ ውስጣዊ ትስስር ተብሎ የሚጠራው ወይም በፕሮቲን ውስብስቦች ውስጥ ያሉ ንዑሳን ክፍሎች፣ ግንኙነቶች ተብለው ይጠራሉ።ይህን አካሄድ በመጠቀም፣ በርካታ አዳዲስ የፕሮቲን-ፕሮቲን ውህዶችን እንዲሁም በኢንተርፌሮን የሚፈጠሩ የባለብዙ ፕሮቲን መስተጋብር መረቦችን ለይተናል።የእነዚህን አዳዲስ መስተጋብሮች ንዑስ ክፍልን የበለጠ በመሞከር፣ H2BFS (H2B histone-type FS፣ከዚህ በኋላ H2B እየተባለ የሚጠራው) እና ኤምዲኤን1 ለHLA-A አስገዳጅ አጋሮች ሆነው እንደሚሠሩ እናሳያለን።
ፍሎ-1 ሴሎች የኢሶፈገስ ዕጢዎች 22,23 ቁልፍ ባህሪያትን ስለሚመስሉ የኢሶፈገስ adenocarcinoma በብልቃጥ ውስጥ ከሚታወቁ በጣም ታዋቂ ሞዴሎች ውስጥ አንዱ ነው።ነገር ግን፣ ሁሉም ዕጢዎች የበሽታ መከላከያ (immunogenic) አይደሉም፣ እና የፍሎ-1 ህዋሶች ለኢንተርፌሮን ህክምና ምላሽ እንደሰጡ ለማወቅ፣ ፍሎ-1 ሴሎችን በ10 ng/ml IFNα ለ72 ሰአታት ወስደናል።የፍሎ-1 ህዋሶች የ pSTAT1 እና IRF1 ቀድመው መጀመራቸውን አሳይተዋል፣ ከህክምናው በኋላ ከ2 ሰአት ጀምሮ እና ለ 72 ሰአታት ሲቀጥሉ፣ በጊዜ-ጥገኛ በሆነ የቋሚ የ IRF1 ደረጃ መቀነስ (ምስል 1A)።ISGs (MX1፣ IFITM1፣ OAS1/2፣ እና ISG15) ከ6 ሰአታት በኋላ በጠንካራ ተነሳሽነት ተገኝተው ለIFNα (ምስል 1A) የጥንታዊውን የመሃል እና የኋለኛ ክፍል ምላሾችን በመኮረጅ ተገኝተዋል።እነዚህ መረጃዎች አንድ ላይ ሆነው ይህ ሴሉላር ሞዴል የኢንተርፌሮን ምላሾችን ለማጥናት እንደሚያገለግል ይጠቁማሉ።
ከ IFNα ሕክምና በኋላ በ Flo-1 ሴሎች ውስጥ የልዩነት የፕሮቲን መግለጫ ምላሾች።(A) በFlo-1 ሕዋሳት ውስጥ ያለው የፕሮቲን አገላለጽ በ10 ng/ml IFNα ለ2፣ 6፣ 24፣ 48 እና 72 ሰአታት በተደረገለት የፕሮቲን አገላለጽ የተጠቆሙ የ ISG ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም በimmunoblot ተተነተነ።(ለ) Coomassie ሰማያዊ ቀለም የተቀቡ SDS-ገጽ ጄል ከዲኤስኤስ ጋር ለተጠቆሙ ጊዜያት እና ትኩረቶች ከተሻገሩ በኋላ።(ሐ) የፕሮቲን ማቋረጫ ደረጃን ለመገምገም ከተመሳሳይ ናሙናዎች በ p53 (DO-1) ፀረ እንግዳ አካላት የተመረመረ ተወካይ።
በቦታው ላይ ያለውን የፕሮቲን መስተጋብር ገጽታን ለመያዝ፣ በከፍተኛ የገለባ ንክኪነት እና በአንጻራዊነት አጭር ምላሽ ጊዜ ምክንያት በሰፊው ጥቅም ላይ የዋለውን አቋራጭ ወኪል የሆነውን DSS ተጠቀምን።አጭር ምላሽ ጊዜ crosslinked ፕሮቲኖች ትልቅ ድምር ምስረታ ለመከላከል ይረዳል, በዚህም crosslinker ያለውን መረጋጋት ጠብቆ.ትክክለኛውን የ DSS ትኩረት ለመወሰን እና ከመጠን በላይ መሻገርን ለማስወገድ በመጀመሪያ ሴሎቹን ለ 5 ፣ 2.5 እና 1 mM DSS ለ 5 ፣ 10 ፣ 5 እና 30 ደቂቃዎች በቅደም ተከተል አጋልጠናል እና ሊዛቶቹን በ Coomassie-stained SDS-PAGE ተንትነዋል። (ውሂቡ አልታየም) .የሕዋስ ሊዛዎች በዝቅተኛው ትኩረት እና በአጭር ጊዜ ውስጥ በጣም የተሻገሩ ሆነው ይታያሉ።ስለዚህ, DSS በ 5 ደቂቃዎች ውስጥ ወደ 1, 0.5 እና 0.1 mM ደረጃ ተሰጥቷል (ምስል 1 ለ).በ 0.5 mM DSS ለ 5 ደቂቃዎች ጥሩ ማቋረጫ ታይቷል, እና እነዚህ ሁኔታዎች በ IFNα ለሚታከሙ ሴሎች ተመርጠዋል.በተጨማሪም፣ ምስል 1C የፕሮቲን ማቋረጫ ደረጃን ለመገምገም p53 (DO-1) ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም የተከናወነ የምዕራባውያን ነጠብጣብ ያሳያል።
የፍሎ-1 ሴሎች ማቋረጫውን ከመጨመራቸው በፊት ለ 24 ሰዓታት በ 10 ng / ml IFNα ታክመዋል.ተያያዥነት ያላቸው ሴሎች በመቀጠል በሁለት-ደረጃ ፕሮቲዮሊሲስ እና ፕሮቲኖች በ FASP (ምስል 2) 24,25 ተካሂደዋል.የተሻገሩ ትራይፕቲክ peptides በጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (ምስል 2) ተንትነዋል.የኤምኤስ/ኤምኤስ ስፔክትራ ከፕሮቲን ቅደም ተከተል ጋር ይዛመዳል እና በ MaxQuant26,27 ይለካሉ።የተሻገሩ peptides የሲም-ኤክስኤል ፕሮግራምን በመጠቀም ከተገኘው ስፔክትራ ተለይተዋል እና የግለሰብ ውህዶች በ xQuest28 እና SIM-XL29 ክፍት ምንጭ ኮምፒውቲንግ ሶፍትዌር ቧንቧዎችን በመጠቀም ወደ ውስብስብ አውታረመረብ ተጣምረዋል (ምስል 2).ሲም-ኤክስኤል የፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብርን፣ የውስጥ ሰንሰለቶችን እና ነጠላ ሰንሰለቶችን በቀላል ወይም ውስብስብ የፕሮቲን ውህዶች ውስጥ ይለያል እና በፕሮቲን አወቃቀሮች ውስጥ ያለውን መስተጋብር ለመመልከት ስክሪፕቶችን ያቀርባል።በተጨማሪም፣ እያንዳንዱን ማመሳከሪያ እንደ መታወቂያ ነጥብ እንደ MS/MS29 ስፔክትረም ደረጃ ያስቀምጣል።በርካታ በጣም አስተማማኝ የፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብር እና ውስብስቦች ተለይተዋል, እና አዲስ የግንኙነት ስብስብ በሞለኪውላዊ ተለዋዋጭ (ኤምዲ) ሞለኪውል (ሞለኪውላር ዳይናሚክስ) ሞዴሊንግ (ምስል 2) 30, 31 የተቀናጀ የስብስብ ለውጦችን በመጠቀም ተጨማሪ ምርመራ ተደርጓል።
የ CLMS ዘዴ አጠቃላይ እይታ።የፍሎ-1 ሴሎች በ 10 ng/ml IFNα ለ 24 ሰአታት ታክመዋል ከዚያም በሳይቱ ፕሮቲን ማቋረጫ DSS በመጠቀም ከዚያም ሴል ሊሲስ እና ትራይፕሲንዜሽን።ተያያዥነት ያላቸው ናሙናዎች በኦርቢትራፕ mass spectrometer በመጠቀም የተተነተኑ ሲሆን በኤልሲ-ኤምኤስ/ኤምኤስ ወቅት የፔፕታይድ ቅድመ-ቁራጮችን ለመከፋፈል ተጨማሪ ናሙና ተወስደዋል።ከተገኘው ስፔክትረም ሁለት የተገናኙ peptides ተለይተዋል የስፔክትረም ማወቂያ ማሽን የ Crosslinked Peptides (SIM-XL) ፕሮግራም እና ሁሉም ውህዶች የስሌት ቧንቧዎችን በመጠቀም ወደ ውስብስብ አውታረመረብ ተጣምረዋል።በሐሰት አዎንታዊ ተመን (FDR) ውጤቶች ላይ በመመስረት ዝቅተኛ በራስ መተማመን ግንኙነቶችን አጣራ።በርካታ አዳዲስ ከፍተኛ-ፊደልሊቲ ፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብሮች በጋራ የመከላከል አቅምን በመጠቀም ተረጋግጠዋል፣ እና በውስብስቦቹ ውስጥ የተስተካከሉ ለውጦች ሞለኪውላዊ ተለዋዋጭ (ኤምዲ) ሞዴሊንግ በመጠቀም ተፈትሸዋል።
በአጠቃላይ ~30,500 እና ~28,500 peptides MaxQuant ን በመጠቀም ያልተነቃቁ እና በተቀሰቀሱ የIFNα ናሙናዎች ውስጥ ተገኝተዋል (ተጨማሪ ሠንጠረዥ S1፣ ምስል 3A)።በሁለቱም ሁኔታዎች የፔፕታይድ ርዝማኔ ስርጭት ከፍተኛ መጠን ያላቸውን ትላልቅ peptides ያሳያል, ይህም የተሻገሩ peptides (ምስል 3 ቢ, ሲ) መኖሩን ያሳያል.በተጨማሪም በ IFNα የታከሙ ናሙናዎች (ምስል 3C) ውስጥ በ 40-55 ክልል ውስጥ ትልቅ መጠን ያላቸው ትላልቅ peptides ይገኛሉ.ከሎግ2 ጥንካሬ አንጻር የፕሮቲን ካርታ ስራ እንደሚያሳየው ክላሲክ ኢንተርፌሮን የሚያነቃቁ ፕሮቲኖች MX1፣ IFIT1/3፣ OAS2/3፣ DDX58 እና HLA-F (ምስል 3D)ን ጨምሮ ካልታከሙ ናሙናዎች ጋር ሲነፃፀሩ በጣም የበዙ ናቸው።የ Reacome pathway ዳታቤዝ በመጠቀም ለ IFNα ህክምና ምላሽ ለመስጠት ከሶስት እጥፍ በላይ የበለፀጉ ፕሮቲኖች የበለፀጉ መንገዶች ትንተና MHC-I-mediated antigen አቀራረብ እና ሂደት ዋነኛው መንገድ መሆኑን ያሳያል (ምስል 3E)።ከቀደምት ሪፖርቶች ጋር በሚስማማ መልኩ በ OAS እና ISG15 እንዲሁም በ IFNα/β እና በሳይቶኪን ምልክት የተደረገባቸው የፀረ-ቫይረስ ምላሾች ገቢር ከሆኑት መንገዶች መካከል ናቸው።በተጨማሪም, የላይሲን እና ሴሪን-ተኮር የፕሮቲን መስቀለኛ መንገድ ሲም-ኤክስኤልን በመጠቀም ከመጀመሪያው የተገኘው MS/MS spectra ተለይቷል.በቅርብ የተደረገ ጥናት ከ9 የቫይረስ ክፍሎች 20 ቫይረሶችን የሚሸፍኑ 104 አይኤስጂዎች በ5 የሴል አይነቶች 9 በግለሰብ የ ISG ከመጠን በላይ የመግለፅ ጥናቶችን በሜታ-ትንተና ዘግቧል።ነገር ግን፣ ትላልቅ የውሂብ ስብስቦችን የማጣራት የስሌት ውስንነቶችን ለማሸነፍ፣ በፓዳሪያ እና ሌሎች በተዘገበው የ IRDS ጂኖች ዝርዝር መካከል ሊኖር የሚችለውን መስተጋብር ለመዳሰስ በትንሽ የውሂብ ስብስብ ጀመርን ፣ አብዛኛዎቹ ISGs ናቸው።
ለIFNα ምላሽ (ከMaxQuant የተገኘ መረጃ) በተለየ መልኩ የተገለጹ የተሻገሩ ፕሮቲኖችን መለየት።(ሀ) በ IFNα14 የታከሙ እና ያልታከሙ የFlo-1 ናሙናዎች ተለይተው የሚታወቁትን የተለመዱ እና ልዩ የሆኑ peptides ብዛት የሚወክል የቬን ዲያግራም።ያልታከሙ (ቢ) እና IFNα የታከሙ (C) የተሻገሩ ናሙናዎች የፔፕታይድ ርዝመት ስርጭት።(መ) ሎግ2ን የሚወክል የሙቀት ካርታ (LFQ intensity) ባልታከመ እና በIFNα14 በፍሎ-1 ህዋሶች መካከል።የግራ ፓነል IFNα በሚኖርበት ጊዜ በጣም ንቁ የሆኑ ፕሮቲኖችን ያሳያል።(ኢ) ሂስቶግራም ከIFNα ሕክምና በኋላ 20 ዋና የማበልጸጊያ መንገዶችን ይወክላል።የReacome መንገድ ዳታቤዝ ቁጥጥር በተደረገላቸው የIFNα ምላሽ ሰጪ ፕሮቲኖች ላይ ከአራት እጥፍ በላይ ለውጦችን ተንትኗል።
የኢንተርፌሮን መካከለኛ የ ISG ማነቃቂያ በደንብ ተመዝግቧል፣ ነገር ግን በሞለኪውላዊ ደረጃ እነዚህ ፕሮቲኖች በተለያዩ ባዮሎጂያዊ ተግባራት ውስጥ እንዴት እንደሚጠናቀቁ በደንብ አልተረዳም።በሚታወቁ ISGs መካከል በከፍተኛ መተማመን የፕሮቲን ግንኙነቶችን መርምረናል።የሚገርመው፣ ለIFNα ሕክምና ምላሽ ለመስጠት ትልቅ ውስብስብ የሆነውን MX1፣ USP18፣ ROBO1፣ OAS3 እና STAT1 ፕሮቲኖችን ጨምሮ ኔትወርክን ለይተናል።በጣም አስፈላጊው ነገር እነዚህ ግንኙነቶች በ IFNα በሚታከሙ በሁሉም የሶስትዮሽ ክፍሎች ውስጥ የተገኙ እና ያልተጠበቁ ናሙናዎች ውስጥ አልተገኙም, ይህም በተለይ ለ IFNa ህክምና ምላሽ እንደተፈጠሩ ይጠቁማል.STAT1 የነዚህን አይኤስጂዎች አገላለጽ ወደ ግልባጭነት እንደሚቆጣጠር ይታወቃል፣ ነገር ግን በፕሮቲን ደረጃ ከ ISGs ጋር ያለው ግንኙነት አልተጠናም።የ STAT1 ክሪስታል አወቃቀር እንደሚያሳየው የሂሊካል ዶሜይን (ሲሲዲ) ዲሜርስ35 በሚፈጠርበት ጊዜ ከዲ ኤን ኤ ወይም ፕሮቶመሮች ጋር ባለው ግንኙነት ውስጥ አልተሳተፈም።እነዚህ α-helices መስተጋብር 35 እንዲፈጠር አብዛኛው የሃይድሮፊሊክ ወለል አካባቢ የሚሰጥ ሄሊካል ሄሊክስ መዋቅር ይመሰርታሉ።በእኛ የCLMS መረጃ፣ ከSTAT1 ጋር አብዛኛዎቹ ግንኙነቶች የተከሰቱት ከሲሲዲ፣ ከአገናኝ ጎራ ወይም ከ C-terminal ጅራት (ቅሪ 700-708) (ምስል 4A) በፊት ባለው የ SH2 ጎራ ውስጥ መሆኑን አስተውለናል።ቀደም ሲል የተደረገ ጥናት USP18 ከሲሲዲ እና ከዲኤንኤ-ቢንዲንግ ጎራ (ዲቢዲ) የ STAT2 ጋር ይተሳሰራል እና ከ I ኢንተርፌሮን ተቀባይ IFNAR2 ንዑስ ክፍል ጋር በመቀጠር የ I interferon ምልክት 24 ን መከልከልን ያማክራል።የእኛ መረጃ በተጨማሪ USP18 catalytic domain ከSTAT1 DBD (ምስል 4A,D) ጋር መስተጋብር ይፈጥራል፣ይህም ሁለቱም STAT1 እና STAT2 USP18ን ወደ IFNAR2 በመሳብ ረገድ ሚና ሊጫወቱ እንደሚችሉ ይጠቁማል።
የፕሮቲን-ፕሮቲን ISG አውታረመረብ በIFNα በሚታከሙ ተያያዥ ሕዋሳት ውስጥ ተለይቷል።(ሀ) 2D መስተጋብር ሴራ የፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብርን ያሳያል (በሲም-ኤክስኤል ፕሮግራም ውስጥ የተፈጠረ)፣ የኢንተር ሞለኪውላር መስተጋብርን የሚወክሉ መስመሮች (ክሮስሊንክ መቆራረጥ ወደ 3.5 ተቀናብሯል)።የተለያየ ማንነት ያላቸው ጎራዎች በቀለማቸው32፡- MX1 ጎራ፣ Dynamin_N (73–249)፣ Dynamin_M (259–547) እና GED (569–660) ምልክት ተደርጎባቸዋል።OAS3 ጎራዎች፡ OAS1_C (160-344)፣ OAS1_C (559-745)፣ NTP_transf_2 (780-872) እና OAS1_C (903-108)።ጎራ ROBO1፣ Ig_3 (67–151)፣ I-set (170–258)፣ I-set (262–347)፣ Ig_3 (350–432)፣ Ig_3 (454–529)፣ fn3 (562–646)፣ fn3 (678-758) እና fn3 (777-864)።STAT1 መስኮች፡ STAT_int (2–120)፣ STAT_alpha (143–309)፣ STAT_bind (321–458)፣ SH2 (573–657) እና STAT1_TAZ2bind (715–739)።(ለ) ክበባዊ ግንኙነት ያላቸው ፕሮቲኖች (MX1፣ UBP18፣ OAS3፣ ROBO1፣ እና STAT1) በሰማያዊ እና በቀይ ከተሰየሙ መስተጋብሮች ጋር።የአገናኝ መንገዱ ገደብ 3.5 ላይ ተቀምጧል።የነጥብ ቦታዎች የSTAT1 መስተጋብር ጣቢያዎችን ከMX1 (C)፣ USP18 (D)፣ ROBO1 (E) እና OAS3 (F)፣ እንዲሁም በሁለቱ peptides መካከል የK ወይም S መስተጋብር ቦታዎችን ያመለክታሉ።በሥዕሉ ላይ፣ የአገናኝ መንገዱ የውጤት ገደብ ወደ 3.0 ተቀናብሯል።(ጂ) በ STAT1 እና OAS3 DI ጎራዎች መካከል ያሉ የተለያዩ የመስተጋብር ቦታዎች በፒሞል (PyMOL ሞለኪውላር ግራፊክስ ሲስተም፣ ስሪት 2.0 Schrödinger፣ LLC.) ላይ በፕሮቲን አወቃቀራቸው ላይ ተደራርበው።STAT1 (pdb መታወቂያ፡ 1bf533) እና OAS3 (pdb መታወቂያ፡ 4s3n34)።) ፕሮግራም.
ሁለት የ USP18 አይዞፎርሞች በሰዎች ውስጥ ተገልጸዋል፣ በአብዛኛው በኒውክሊየስ ውስጥ የሚገኝ ሙሉ ርዝመት ያለው ፕሮቲን እና ኢሶፎርም ያለ N-terminal domain USP18-sf በሳይቶፕላዝም እና ኒውክሊየስ 36 ውስጥ በእኩል መጠን ይሰራጫል።በተጨማሪም N-terminus ያልተዋቀረ ነው ተብሎ ተንብየዋል እና የ isopeptidase እንቅስቃሴን ወይም ISG1537 ማሰሪያ አያስፈልገውም።በጥናታችን ውስጥ የተገለጹት አብዛኛዎቹ መስተጋብሮች በፕሮቲን N-terminus ላይ ይገኛሉ, እነዚህ ግንኙነቶች ሙሉ ርዝመት USP18 (ምስል 4A,D) የሚያካትቱ እና በዚህም ምክንያት በኒውክሊየስ ውስጥ ሊከሰቱ እንደሚችሉ ይጠቁማል.በተጨማሪም የኛ መረጃ N-terminus ከፕሮቲን-ወደ-ፕሮቲን መስተጋብር ልዩ መሆኑን ያሳያል።የ IFNAR2 ማሰሪያ ቦታ በ 312-368 ቅሪቶች መካከል የሚገኝ ሲሆን በተለይም በውስብስብ ውስጥ ካሉት ፕሮቲኖች ውስጥ አንዳቸውም ከዚህ ክልል ጋር አይገናኙም (ምስል 4A) 37,38 .እነዚህ አንድ ላይ የተወሰዱ መረጃዎች የIFNAR2 ማሰሪያው ጎራ በተቀባይ ፕሮቲን ብቻ ጥቅም ላይ እንደሚውል ያመለክታሉ።በተጨማሪም፣ OAS3 እና ROBO1 ብቻ ከN-terminus እና IFNAR2 ማሰሪያ ጣቢያ (ምስል 4A) በላይ ካሉ ጎራዎች ጋር የተቆራኙ ሆነው ተገኝተዋል።
ROBO1 የኢሚውኖግሎቡሊን (Ig) የትራንስሜምብራን ምልክት ሞለኪውሎች ሱፐርፋሚሊ ነው እና ከሴሉላር ክልል ውስጥ አምስት Ig ጎራዎችን እና ሶስት ፋይብሮኔክቲን (Fn) ጎራዎችን ያቀፈ ነው።እነዚህ ከሴሉላር ውጭ ያሉ ጎራዎች በሜምበር-ፕሮክሲማል ክልል እና በነጠላ ትራንስሜምብራን ሄሊክስ 39 ይከተላሉ። ያልተዋቀረ ውስጠ-ህዋስ ክልል በ C-terminus ላይ የሚገኝ ሲሆን ተፅዕኖ ፈጣሪ ፕሮቲን ትስስር39ን የሚያስተናግዱ የተጠበቁ ተከታታይ ጭብጦችን ይይዛል።ከአሚኖ አሲዶች ~ 1100 እስከ 1600 ያለው ክልል በአብዛኛው የተዘበራረቀ ነው።MX1 ከ ROBO1 ጋር በ Ig፣ Fn እና intracellular ጎራዎች በኩል መስተጋብር እንደሚፈጥር ደርሰንበታል፣ ከSTAT1 ጋር አብዛኛዎቹ ግንኙነቶች በሲሲዲ፣ በአገናኝ ጎራ እና በ ROBO1 C-terminus (ምስል 4A,E) መካከል ይከሰታሉ።በሌላ በኩል ከ DI, DIII እና OAS3 አገናኝ ክልሎች ጋር ያሉ ግንኙነቶች በ ROBO1 ፕሮቲን ውስጥ ተሰራጭተዋል (ምስል 4A).
የ oligoadenylate synthase (OAS) ፕሮቲን ቤተሰብ በሴሉላር ድርብ-ክር አር ኤን ኤ (dsRNA) ይቀበላል እና ያስራል፣ የተስተካከሉ ለውጦችን ያደርጋል፣ እና 2′፣5′-linked oligoadenylates (2-5 As) 40 ን ያዋህዳል።ከሶስቱ OAS ዎች መካከል OAS3 ለ dsRNA ከፍተኛውን ግንኙነት ያሳያል እና አነስተኛውን 2-5 As ያዋህዳል ፣ ይህም RNase L ን ማግበር እና በዚህም የቫይረስ ማባዛትን 41 ይገድባል።የOAS ቤተሰብ የ polymerase beta (pol-β) -እንደ ኑክሊዮታይድ ማስተላለፊያ ጎራዎችን ያካትታል።ቀደም ሲል የተደረገ ጥናት እንደሚያሳየው የ C-terminal domain (DIII) የካታሊቲክ እንቅስቃሴ OAS342 ለማንቃት በሚያስፈልገው በ dsRNA-binding domain (DI) ላይ የተመሰረተ ነው.የ DI እና DII የOAS3 ጎራዎች ከሲሲዲ እና ከ SH2 እና STAT1 TAD (ምስል 4A፣F) መካከል ካለው ትንሽ መጋጠሚያ ክልል ጋር መስተጋብር እንደሚፈጥሩ ተመልክተናል።በፕሮቲን አወቃቀሩ ላይ የተለያዩ ማቋረጫ ቦታዎች መደራረብ በ β-sheet እና DBD STAT1 loop እና ክፍት ኪስ ወይም ክፍተት መካከል በ60-75 ተረፈ በOAS3 (ምስል 4ጂ) መካከል ያለውን መስተጋብር አሳይቷል።በውስብስቡ ውስጥ ያሉት የፕሮቲኖች አቅጣጫ እንደሚያመለክተው ከOAS3 ጋር ያለው የትኛውም መስተጋብር በዲአይኤ ጎራ (ምስል S1A) የዲኤንኤ ትስስር ችሎታ ላይ ጣልቃ እንዳልገባ አመልክቷል።በተጨማሪም፣ የGTPase MX1 N-terminal ጎራ ከDI እና DIII ጎራዎች OAS3 (ምስል 4A) ጋር በስፋት ይገናኛል።እንዲሁም በOAS1 እና MX1 መካከል በ IFNα የታከሙ ድግግሞሾች ውስጥ በOAS1 እና በኤምኤክስ1 መካከል ያለውን መስተጋብር ተመልክተናል፣ አንድ የOAS1 ጎራ (እንዲሁም በንቃት ንቁ) ከሦስቱም MX1 ጎራዎች (ምስል S2A፣B) ጋር መስተጋብር ይፈጥራል።
ኤምኤክስ ፕሮቲኖች GTPን የሚያቆራኝ እና ሀይድሮላይዝስ የሚያደርግ N-terminal GTPase ጎራ ያለው እንደ ዳይኒን መሰል ጂቲፓሴስ ትልቅ ቤተሰብ፣ ራስን መሰብሰብን የሚያገናኝ መካከለኛ ጎራ እና እንደ GTPase (LZ) የሚሰራ C-terminal leucine ዚፔር ናቸው። ).ጎራ ተፅዕኖ ፈጣሪ domain25,43.ኤምኤክስ1 ከቫይራል ፖሊመሬሴዎች ንዑስ ክፍሎች ጋር የቫይራል ጂን 43 ግልባጭን ለማገድ ይያያዛል።ቀደም ሲል የተዘገበው እርሾ ሁለት-ድብልቅ ስክሪን እንደሚያሳየው PIAS1-የተዛመደ MX1 የ STAT1-መካከለኛ የጂን እንቅስቃሴን በዲ ኤን ኤ ማሰሪያ እንቅስቃሴን በመከልከል እና SUMO E344,45 ligase እንቅስቃሴ እንዳለው ያሳያል።እዚህ፣ MX1 ከ STAT1 ጋር እንደሚቆራኝ እናሳያለን (ምስል 4C,D) ሆኖም ይህ መስተጋብር በSTAT1-mediated gene activation ላይ እንዴት ለIFNa ምላሽ እንደሚሰጥ ተጨማሪ ጥናት ያስፈልገዋል።በተጨማሪም፣ MX1 ከIFIT3 እና DDX60 ጋር በሦስቱም IFNα-የተያዙ ድግግሞሾች (ምስል S2C) መስተጋብር እንደፈጠረ አግኝተናል።
DDX60 የ IFN-induced ሳይቶፕላዝም ሄሊኬዝ ሲሆን ቀደም ሲል በ RIG-I-ነጻ የቫይረስ ኤን ኤ 46 መበላሸት ውስጥ ሚና እንዳለው ሪፖርት ተደርጓል።ከRIG-I ጋር ይገናኛል እና ምልክቱን በ ligand-specific 46. DDX60 የ DEXD/H-Box ሄሊኬዝ ጎራ እና የቫይረስ አር ኤን ኤ እና ዲ ኤን ኤ 47ን የሚያገናኝ የ C-terminal helicase domain ይዟል።ከ MX1 እና IFIT3 ጋር ያለው አብዛኛው መስተጋብር በረጅም N- እና ሲ-ተርሚናል ክልሎች ያለ ቀኖናዊ ጎራዎች ወይም ጭብጦች (ምስል S2E፣F) ይከሰታሉ።ሆኖም፣ MX1 ከ DEXD/H-Box ሄሊኬዝ ጎራ (ምስል S2E) ጋር የተያያዘ ነው።የIFIT ቤተሰብ ፕሮቲኖች ቴትራፔፕታይድ ድገም (TPR) የሚባል ልዩ የሄሊክስ-ተርን-ሄሊክስ ሞቲፍ የታንዳም ቅጂ አላቸው።IFIT3 የ RIG-I ምልክት ማድረጊያ አወንታዊ ሞዱላተር ሆኖ ተገኝቷል ስለዚህም የ MAVS ውስብስብ አካል ነው።አንድ ላይ ስንጠቃለል፣ IFIT3 እና DDX60 በዋናነት በ TPR 3-6 ከIFIT3 መካከል ባለው ክልል ውስጥ መስተጋብር እንደሚፈጥሩ እና በ RIG-I/MAVS ምልክት (ምስል S2F) ላይ ሚና ሊጫወቱ እንደሚችሉ መረጃዎቻችን ይጠቁማሉ።
አጠቃላይ ፕሮቲዮሙን ማጣራት በኮምፒዩቲሽን የተጠናከረ ከመሆኑ አንጻር፣ ከዚያም በIFNα የታከሙት ድግግሞሾች አንዱን መኖሩን መላውን የሰው UniProt ዳታቤዝ አጣራን።በዚህ ቅጂ ለHLA-A በርካታ በጣም አስተማማኝ የመስተጋብር መረቦችን አግኝተናል።በ MS/MS spectra ተለይተው የታወቁ የፕሮቲን መንገዶች ትንተና MHC-I ላይ የተመሰረተ አንቲጅንን ማቀናበር እና አቀራረብ በኢንተርፌሮን (ምስል 3D) የሚነሳ ዋና መንገድ መሆኑን ያሳያል.ስለዚህ, በሁሉም የተሻገሩ ናሙናዎች ላይ በከፍተኛ እምነት የ MHC-I ሞለኪውሎች የፕሮቲን ግንኙነቶችን በማጥናት ላይ አተኩረን ነበር.HLA α1፣ α2 እና α3 ጎራዎችን እና የብርሃን ሰንሰለቶችን ያቀፈ ሲሆን ማይክሮግሎቡሊን β2 (β2m) ቋሚ የቻፐር ፕሮቲን49 ነው።አንድ ጊዜ በ endoplasmic reticulum ውስጥ ከተሰበሰበ, HLA peptide ligands50 በማይኖርበት ጊዜ ያልተረጋጋ ነው.የፔፕታይድ-ቢንዲንግ ግሩቭ በከፍተኛ ፖሊሞርፊክ እና ያልተዋቀረ α1 እና α2 ጎራዎች በፔፕታይድ ያልሆኑ ቅርጾች እና በአንጻራዊነት ባነሰ ፖሊሞፈርፊክ α351 ጎራ የተሰራ ነው።በ IFNα ፊት, ሁለት የ HLA-A ውስብስቦችን አግኝተናል-አንደኛው ከHMGA1 እና H2B ጋር ይገናኛል (ምስል 5, ሠንጠረዥ S3) እና ሌላኛው ከ MDN1, LRCH4 እና H2B ጋር ይገናኛል (ስእል 6).
IFNα የHLA-A መስተጋብር አውታረ መረብን ከH2B (H2BFS) እና HMGA1 ጋር ያነሳሳል።(ሀ) 2D ሴራ (በሲም-ኤክስኤል ሶፍትዌር የተፈጠረ) በH2B-HLA-A-HMGA1 ኮምፕሌክስ ውስጥ የተለያዩ አይነት መስተጋብርን ያሳያል፡ interlink (ሰማያዊ)፣ interlink (ቀይ) እና ነጠላ ማገናኛ (ጥቁር)።.የተለያየ ማንነት ያላቸው ጎራዎች በቀለም ኮድ32፡ H2B (ሂስቶን፤ 2–102) እና MHC-I (MHC_1፤ 25–203፣ ቡድን C1፤ 210–290 እና MHC_I_C፤ 337–364) ናቸው።የአገናኝ መንገዱ ገደብ 3.5 ላይ ተቀምጧል።የነጥብ ቦታዎች የHLA-A መስተጋብር ቦታዎችን ከH2B (B) እና HMGA1 (C)፣ እንዲሁም በሁለቱ peptides መካከል የK ወይም S መስተጋብር ቦታዎችን ያመለክታሉ።በሥዕሉ ላይ፣ የአገናኝ መንገዱ የውጤት ገደብ ወደ 3.0 ተቀናብሯል።(D) በPyMOL ፕሮግራም ውስጥ በH2B፣ HLA-A እና HMGA1 ፕሮቲኖች አወቃቀሮች ላይ የሚታዩ ፕሮቲኖች ግንኙነት።እነዚህ መዋቅሮች Phyre2 አገልጋይ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) እና የH2B፣ HLA-A እና HMGA1 ፕሮቲኖች የአብነት አወቃቀሮች 1kx552፣ 1kj349 እና 2eze55 ነበሩ በቅደም ተከተል።
IFNα የHLA-A መስተጋብር አውታረ መረብን ከH2B (H2BFS)፣ MDN1 እና LRCH4 ጋር ይፈጥራል።(ሀ) የውስጠ ሞለኪውላር (ቀይ) እና የኢንተር ሞለኪውላር (ሰማያዊ) ማቋረጫዎች በ2D መስተጋብራዊ ካርታ ላይ ቀርበዋል (በሲም-ኤክስኤል ሶፍትዌር የተፈጠረ) ኤምዲኤን1 በክበብ ተወክሏል።የአገናኝ መንገዱ ገደብ 3.5 ላይ ተቀምጧል።የተለያየ ማንነት ያላቸው ጎራዎች በቀለም ኮድ32፡ H2B (ሂስቶን፤ 2–102)፣ MHC-I (MHC_1፣ 25–203፣ ቡድን C1፣ 210–290 እና MHC_I_C፣ 337–364) እና LRCH4 (LRR_8 (68–126)፣ LRR_8 (137–194) እና CH (535–641))።(ለ) በPyMOL ፕሮግራም ውስጥ በH2B፣ HLA-A፣ LRCH4 እና MDN1 ፕሮቲኖች አወቃቀሮች ላይ የሚታዩ ፕሮቲኖች ግንኙነት።እነዚህ መዋቅሮች Phyre2 አገልጋይ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ከአብነት መዋቅሮች 1kx552፣ 1kj349፣ 6hlu62 እና 6i2665 ጋር ለH2B፣ HLA-A፣ LRCH4 እና MDN1 ፕሮቲኖች ተቀርፀዋል። በቅደም ተከተል.የነጥብ ቦታዎች ለHLA-A ከH2B (C)፣ LRCH4 (D) እና MDN1 (E) ጋር የK ወይም S መስተጋብር ቦታዎችን ያሳያሉ።ለሴራዎች፣ የአገናኝ መንገዱ የውጤት ገደብ ወደ 3.0 ተቀናብሯል።
ሂስቶን ኤች 2ቢ የጂኖምን ትክክለኛነት ከመጠበቅ በተጨማሪ በጽሑፍ ግልባጭ ደንብ ውስጥ ይሳተፋል።የ H2B ፕሮቲን በሶስት α-ሄሊስ በ loops እና በ C-terminal ጅራት 41,52 የተሰራውን ማዕከላዊ ሂስቶን ዶሜይን (HFD) ያካትታል።አብዛኛው ከH2B ጋር ያለው መስተጋብር የሚከሰተው በ α1 ሄሊክስ ውስጥ ሲሆን ይህም ከኤችኤፍዲ ሄትሮዲመር (ምስል 5A, B) ጋር trimerization ያቀርባል.ምንም እንኳን ሊሲን በዲኤንኤ ትስስር ውስጥ ቢሳተፉም አንዳንድ ሊሲን እንዲሁ አማራጭ አሲቴላይዜሽን ወይም ሜቲሌሽን ሳይቶች ናቸው።ለምሳሌ፣ ከH2B የሚመጡ የK43፣ K46 እና K57 ቅሪቶች በቀጥታ ዲኤንኤ ትስስር ውስጥ አይሳተፉም፣ ነገር ግን የተለያዩ የድህረ-ጽሑፍ ማሻሻያዎች ዒላማዎች53 ናቸው።በተመሳሳይ፣ በH2B ውስጥ ያሉ የK44፣ K47 እና K57 ቅሪቶች IFNα ሲኖሩ ከሌሎች ፕሮቲኖች ጋር ያለውን ግንኙነት ጨምሮ አማራጭ ሚና ሊጫወቱ ይችላሉ (ምስል 5A፣ B)።በተጨማሪም ኤክስትራክሮሞሶም ሂስቶን H2B በተለያዩ የሕዋስ ዓይነቶች የበሽታ መከላከያ ምላሽን ያንቀሳቅሳል፣ እንደ ሳይቶሶሊክ ሴንሰር ሆኖ ከተላላፊ ወኪሎች ወይም ከተበላሹ ህዋሶች የተገኙትን ድርብ-stringed DNA (dsDNA) ቁርጥራጮችን ለመለየት ይሠራል።የዲ ኤን ኤ ቫይረሶች በሚኖሩበት ጊዜ, የ H2B መሟጠጥ የ IFN-β ምርትን እና STAT154 ፎስፈረስላይዜሽን ተከልክሏል.H2B ከሌሎች የኮር ሂስቶን 54 በበለጠ ፍጥነት ወደ ኒውክሊየስ ለመግባት እና ለመውጣት ይታወቃል።የH2B መስተጋብር ከ MDN1 እና LRCH4 ጋር በተመረጡት ያልታከሙ ናሙናዎችም ተስተውሏል።HLA-A ከH2B ጋር በሦስቱም IFNα የታከሙ ናሙናዎች እና አንድ ያልታከመ የድጋሚ ናሙና ውስጥ አግኝተናል።እነዚህ መረጃዎች የH2Bን ሚና ከግልባጭ ደንብ ነፃ በሆነ አማራጭ የፊዚዮሎጂ ተግባር ላይ ያንፀባርቃሉ።
HMGA1 (ከፍተኛ ተንቀሳቃሽነት ቡድን AT-Hook 1)፣ በሽታን የሚያበረታቱ አሚኖ አሲዶች የበለጸገው ትንሽ ኑክሊዮፕሮቲን ከHLA-A ጋር በመተባበር ተለይቷል።እሱ አሲዳማ የሆነ ሲ-ተርሚናል ጅራት እና AT hooks የሚባሉ ሶስት የተለያዩ ዲቢዲዎች አሉት ምክንያቱም በ AT-ሀብታም ክልል ውስጥ ካለው አነስተኛ ጎድጎድ ጋር በdsDNA55,56 ውስጥ ስለሚተሳሰሩ።ይህ ማሰር ዲ ኤን ኤው እንዲታጠፍ ወይም እንዲስተካከል ያደርገዋል፣ ይህም ቀኖናዊ የጽሑፍ ግልባጭ ምክንያቶች ወደ የጋራ ስምምነት ቅደም ተከተል እንዲደርሱ ያስችላቸዋል።C-terminal ጅራቱ በፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብር እና የጽሑፍ ግልባጭ ምክንያቶችን በመመልመል ውስጥ እንደሚሳተፍ ይታመናል፣ ምክንያቱም የC-terminal deletion mutants ግልባጭን መጀመር አይችሉም57።ከዚህም በላይ, ይህ ጎራ ለ kinases 58 የሚታወቁ በርካታ የተጠበቁ የፎስፈረስ ቦታዎችን ይዟል.የC-terminal ጎራ በዋናነት ለጽሑፍ ግልባጭ ማሰሪያ (ምስል 5A፣ C) እንደሚውል በመግለጽ የHLA-A እና H2B ከHMGA1 ጋር ከC-terminal ጎራ ውጪ ያለውን ግንኙነት ተመልክተናል።የኤችኤምጂኤ ፕሮቲኖች ከአስማሚ ዲ ኤን ኤ ጋር ለማያያዝ ከሂስቶን H1 ጋር ይወዳደራሉ፣ በዚህም ተደራሽነትን ይጨምራሉ57።በተመሳሳይ፣ ኤችኤምጂኤ ከሂስቶን H2B ጋር ከሂስቶን H1 ጋር በመወዳደር ከአገናኝ ዲ ኤን ኤ ጋር የሚገናኝ ይመስላል።HMGB1 የ HLA-A፣ -B እና -Cን በdendritic ህዋሶች ውስጥ እንዲገለጽ ያነሳሳል፣ይህም ወደ አግብር59 ይመራል፣ነገር ግን በHMG እና HLA መካከል ያለው መስተጋብር ከዚህ ቀደም ሪፖርት አልተደረገም።HMGA1 ከ α1 እና α3 የHLA-A ጎራዎች ጋር መስተጋብር እንደሚፈጥር አግኝተናል፣ ከ3 ዲቢዲ (ምስል 5A፣C) ውጭ ያሉ አብዛኛዎቹ መስተጋብሮች።በእጃችን, HLA-A በኒውክሊየስ ውስጥ ተገኝቶ ተገኝቷል (መረጃ አይታይም), እና H2B እና HMGA1 በኒውክሊየስ ውስጥም ይገኛሉ, ይህ መስተጋብር በኒውክሊየስ ውስጥ ሊከሰት ይችላል.በH2B፣ HLA-A እና HMGA1 መካከል የሚለኩ ልዩ ጥቅሶች በስእል 5D ይታያሉ።
አብዛኛዎቹ የHLA-A ከሌሎች ፕሮቲኖች ጋር የሚደረጉ ግንኙነቶች የሚከሰቱት በ α1 እና α2 ጎራዎች እና በተዘበራረቀ የC-terminal ጎራ (ምስል 6) ውስጥ ነው።ከእነዚህ ምሳሌዎች ውስጥ በአንዱ፣ HLA-A ከተዘበራረቀ የLRCH4 N-terminal ጅራት ጋር መስተጋብር እንደሚፈጥር አግኝተናል (ምስል 6A፣D)።LRCH4 የ TLR4 ን ማግበር እና የ LPS ሳይቶኪን ኢንዳክሽን ይቆጣጠራል፣ በዚህም የተፈጥሮን በሽታ የመከላከል አቅምን60,61 ያስተካክላል።በ ectodomain ውስጥ ዘጠኝ ሉሲን የበለጸገ ድግግሞሾች (LRRs) እና ሴሉዶዱሊን (CH) ሆሞሎጂ ሞቲፍ ያለው የሜምብራን ፕሮቲን ሲሆን ከዚያም ትራንስሜምብራን (TMD) 60, 62 ነው.የ CH ጎራዎች የፕሮቲን-ፕሮቲን ግንኙነቶችን 60 እንደሚያስተናግዱ ሪፖርት ተደርጓል.በLRR እና CH ጎራዎች መካከል ወደ 300 የሚጠጉ አሚኖ አሲዶች በአንፃራዊነት ተደራሽ ናቸው ነገር ግን የተዘበራረቀ ነው።የተዘበራረቁ ክልሎች ተግባር ላይ በመመስረት የፕሮቲን-ፕሮቲን ኔትወርኮች እና የቬሲኩላር ትራንስፖርት 63 አስታራቂዎች, አብዛኛው የፕሮቲን መስተጋብር በተዘበራረቁ ክልሎች ውስጥ እንደሚከሰት ተገንዝበናል.ከኤምዲኤን1 ጋር ያለው መስተጋብር በፕሮቲን ርዝማኔ ውስጥ ተሰራጭቷል፣ LRR1፣ LRR6፣ CH ጎራዎች እና የዘፈቀደ ክልሎችን ጨምሮ፣ H2B በዋናነት ከCH ጎራ (ምስል 6A፣ B) ጋር የተያያዘ ነው።በተለይም፣ የትኛውም መስተጋብር TMJን አላካተተም፣ ይህም የCLMS አቀራረብን ልዩነት ይጠቁማል (ምስል 6A፣ B)።
ኤምዲኤን1 እንደ HLA-A ፕሮቲን አውታር አካል ተለይቷል (ምስል 6A)።እሱ የፕሮቲኖች የ AAA ቤተሰብ ነው (ከተለያዩ እንቅስቃሴዎች ጋር የተቆራኙ ATPases)።ይህ ተመሳሳይ N-terminal AAA ጎራ ወደ ሄክሳሜሪክ ቀለበት የሚያደራጅ እና የመሰብሰቢያውን ከ60S 64 ribosomal ንዑስ ክፍል ያስወግዳል።ከዳይኒን 64,65,66 ጋር ተመሳሳይ ይመስላል.በተጨማሪም, የአስፕ / ግሉ ሀብታም ክልል በ MIDAS ጎራ (የብረት ion ጥገኛ ቦታ) ይከተላል.በኤምዲኤን1 ትልቅ መጠን (በግምት 5600 አሚኖ አሲዶች) እና በደንብ ከተመረመሩ ፕሮቲኖች ጋር ባለው ውስን ግብረ-ሰዶማዊነት ምክንያት በሰዎች ውስጥ ስላለው አወቃቀሩ እና አሠራሩ ብዙም የሚታወቅ ነገር የለም።HLA-A፣ H2B እና LRCH4 እንደ MDN1 አስገዳጅ አጋሮች ለይተናል እና አቅጣጫቸውን በPyMol ውስጥ እንደ ፕሮቲን ውስብስቦች አሳይተናል (ምስል 6A፣B)።እነዚህ ሶስት ፕሮቲኖች ከ AAA ጎራ፣ ዳይይንን ከሚመስለው አገናኝ ጎራ እና ምናልባትም ከMIDAS MDN1 ጎራ ጋር ይገናኛሉ።ባለፈው ዘገባ፣ የባት ፕሮቲኖችን ዝምድና ማጥራት MDN1 ከሂስቶን H2B67 ጋር የተያያዘ ፕሮቲን እንደሆነ ለይቷል።በተጨማሪም፣ በቅርብ የተደረገ ጥናት ደግሞ በኤምዲኤን እና ኤችኤልኤ-ቢ መካከል በHCT116 ሴሎች ውስጥ በአፊኒቲ-የተጣራ የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ በመጠቀም ግኝቶቻችንን68 በመደገፍ መካከል ያለውን መስተጋብር ዘግቧል።በ IFNα የታከሙ ናሙናዎች ውስጥ የዚህን ውስብስብነት መለየት ለ MDN1 በ interferon ምልክት ላይ ያለውን ሚና ይጠቁማል.
HLA ጂኖች በጣም ፖሊሞፈርፊክ በመሆናቸው፣ የፍሎ-1 ህዋሶችን አር ኤን ኤ ቅደም ተከተል መረጃ (ውሂቡ አልታየም) HLA-A፣ -B እና -Cን ካርታ መስራትን አወጣን።ከተከታታይ ንባብ ጋር የሚጣጣሙ የፔፕታይድ ቅደም ተከተሎች በHLA-A, -B እና -C መካከል የተገናኙ peptides በHLA-A ውስጥ በሚገኙባቸው ክልሎች መካከል ከፍተኛ ልዩነት አሳይተዋል (ምስል S3)።በተጨማሪም፣ የ HLA-B/C ሞለኪውሎችን ከH2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 ፕሮቲኖች ጋር ከፕሮቲን ወደ ፕሮቲን መሻገር አላየንም።ይህ የሚያሳየው በHLA-A፣ MDN1፣ LRCH1 እና HMGA1 መካከል ያለው የፕሮቲን መስተጋብር HLA-A የተወሰነ ነው።በተጨማሪም፣ ያልተገናኙ ናሙናዎች (ሠንጠረዥ S4) የፕሮቲዮሚክ ትንታኔ እንደሚያሳየው HLA-A ከHLA-B ወይም HLA-C ጋር ሲነፃፀር ከፍተኛ ተከታታይ ሽፋን አለው።ለHLA-A ተለይተው የሚታወቁት peptides በሁለቱም በ IFNα-በታከሙ እና ባልታከሙ ናሙናዎች ውስጥ ከፍተኛ ጥንካሬ አላቸው.
እዚህ ተለይተው የታዩት መስተጋብሮች በሁለት ፕሮቲኖች መካከል በቅርበት ባለው የቦታ ቅርበት ልዩ ባልሆኑ መሻገሪያ ምክንያት እንዳልሆኑ ለማረጋገጥ፣የጋራ-immunoprecipitation assays በማከናወን ሁለት አዳዲስ የHLA-A መስተጋብር ሁኔታዎችን አረጋግጠናል።HLA-A ከውስጣዊው MDN1 እና H2B ጋር ያለው መስተጋብር በሁለቱም IFNα-በታከሙ እና ባልታከሙ ፍሎ-1 ህዋሶች ውስጥ ተገኝቷል (ምስል 7፣ ምስል S4)።HLA-A በH2B መያዙን አረጋግጠናል።ነገር ግን፣ መረጃዎቻችን እንደሚያሳዩት IFNα የHLA-A ትስስርን ከH2B እና MDN1 በተለየ ሁኔታ ይቆጣጠራል።IFNa በH2B እና HLA-A መካከል ግንኙነትን ይፈጥራል፣ነገር ግን ከኤምዲኤን1 ጋር ያለውን ግንኙነት ይቀንሳል።MDN1 በመቆጣጠሪያዎች ውስጥ ከHLA-A ጋር የተቆራኘ መሆኑን ደርሰንበታል፣ እና የ IFNα መጨመር ይህንን ከኤምዲኤን1 ኢንዳክሽን በ IFNα (ምስል 7B,C) ቀንሷል።በተጨማሪም, የ HLA-A የበሽታ መከላከያ መጠን H2B በ A549 ሕዋሳት (ምስል ኤስ 4) ተይዟል, ይህ መስተጋብር ከሴል ዓይነት ነፃ መሆኑን ይጠቁማል.እነዚህ ውጤቶች አንድ ላይ ሆነው፣ የHLA-Aን ከH2B እና MDN1 ጋር በኢንተርፌሮን-አማላድነት የሚደረጉ ግንኙነቶችን ይደግፋሉ።
HLA-A H2B እና MDN1ን በጋራ ያጸዳል።ተወካዩ ኢንዶጀንስ H2B (A) እና MDN1 (B) immunoblots በ IFNα-የተያዙ ፍሎ-1 ህዋሶች ተከላካይ ተሰጥቷቸዋል እና ለተጠቆሙት ፀረ እንግዳ አካላት ተመርምረዋል።አይጥ እና ጥንቸል IgG እንደ አሉታዊ ቁጥጥር ጥቅም ላይ ውለዋል.(ሐ) የተለያዩ አንቲጂኖች አንጻራዊ መጠን (ግቤት) በተጠቆሙ ፀረ እንግዳ አካላት ላይ በተመረመረ በክትባት መከላከያ (immunoblots) ይታያሉ፣ β-actin እንደ ጭነት መቆጣጠሪያ ጥቅም ላይ ውሏል።
በኢንተርፌሮን-የተፈጠሩት እጅግ አስተማማኝ ተሻጋሪ አውታረ መረቦች የአንደኛው መዋቅራዊ ባህሪያት H2B-HLA-A-HMGA1 ተመርምረዋል።በዚህ ውስብስብ ውስጥ የተካተቱትን ፕሮቲኖች የተመጣጠነ ተለዋዋጭነት ለመረዳት ሞለኪውላዊ ተለዋዋጭ ሞዴሊንግ እንደ አማራጭ አቀራረብ ተጠቀምን (ስእል 8)።ከ CLMS መረጃ የተገኙ ጥቆማዎች የH2B፣ HLA-A እና HMGA1 ፕሮቲኖች የተለያዩ ቅርጾች ሊኖሩ እንደሚችሉ ይጠቁማሉ።ስለዚህ፣ የሚከተሉት እምቅ ውስብስቦች በሟሟ መካከለኛ ተቀርፀዋል፡ H2B-HLA-A፣ HMGA1-HLA-A እና H2B-HLA-A-HMGA1።MOE (ሞለኪውላር ኦፕሬቲንግ ኢንቫይሮንመንት፣ ኬሚካላዊ ኮምፒውቲንግ ግሩፕ ኢንክ.፣ ሞንትሪያል፣ ኩቤክ፣ ካናዳ) ፓኬጅ በመጠቀም የመጀመርያው የፕሮቲን-ፕሮቲን መትከያ ስክሪን በእነዚህ ፕሮቲኖች መካከል የሚለያዩ ቅርጾችን ጠቁሟል (ምስል 8A)።የመትከያ ፕሮቲን ውስብስብ እይታ በርካታ መስተጋብሮችን እና ሊሆኑ የሚችሉ ቅርጾችን አሳይቷል (ምስል 5A, 8).ስለዚህ አንድ ሊመጣጠን የሚችል ኮንፎርሜሽን በስእል 8A (የተሰየመ መስቀለኛ መንገድ ያለው) እና የኤምዲ ሞዴሊንግ ቧንቧ መስመርን በመጠቀም የበለጠ ተገምግሟል።በተጨማሪም፣ የH2B ወይም HMGA1 ከHLA-A ጋር ማያያዝ የH2B ለHLA-A ያለውን ከፍተኛ ዝምድና ያሳያል (ምስል 8A)።
በH2B (H2BFS) -HLA-A፣ HMGA1-HLA-A እና H2B-HLA-A-HMGA1 ውስብስቦች መካከል ሊሆኑ የሚችሉ አውታረ መረቦች የተመጣጠነ ተለዋዋጭነት።(A) የግራ ፓነል 2D ካርታ ነው (በሲም-ኤክስኤል ሶፍትዌር የተፈጠረ) ውስጠ-ሞለኪውላር (ቀይ) እና ኢንተርሞለኩላር (ሰማያዊ) ማቋረጫዎች (ክሮስሊንክ መቆራረጥ ወደ 3.5 ተቀናብሯል)።በተጨማሪም፣ ተሻጋሪ ቅሪቶች ተለይተው የሚታወቁት በH2B፣ HLA-A እና HMGA1 ፕሮቲኖች አወቃቀሮች ላይ ነው።የእነዚህ ፕሮቲኖች ተጓዳኝ ቅርፆች በ MOE ፓኬጅ ውስጥ የተተገበረውን የመትከያ ቧንቧ በመጠቀም ተወስደዋል.የታችኛው የግራ ፓነል የ H2B-HLA-A እና HMGA1-HLA-A ውህዶችን ከተለያዩ ፕሮቲን-ፕሮቲን ማያያዣዎች (GBVI/WSA dG፣ kcal/mol) ጋር የተለያዩ ሊሆኑ የሚችሉ ቅርፆችን ያሳያል።(ለ) ለእያንዳንዱ የፕሮቲን መዋቅር የአቶሚክ አቀማመጥ (ከሃይድሮጂን አቶሞች በስተቀር) መደበኛ መዛባት (RMSD)።(ሐ) ኢንተርሞለኩላር ፕሮቲን-ፕሮቲን ሃይድሮጂን ቦንድ መስተጋብር ከተለያዩ አስመሳይ ውስብስቦች የተወሰኑ የቆይታ ጊዜ ≥ 10 ns መስተጋብርን ግምት ውስጥ በማስገባት።የ h-bond ለጋሽ-ተቀባይ መቁረጫ ርቀት ወደ 3.5 Å, እና ለጋሽ-H-ተቀባይ መቁረጫ አንግል ≥ 160 ° -180 ° ተቀናብሯል.(D) የተሰየሙ የHLA-A ፕሮቲን-ፕሮቲን ከየባልደረባዎቻቸው ጋር መስተጋብር የሚፈጥሩ፣ ≥ 20 ns የሚሸፍኑ፣ ከዱሚ HLA-A-H2B እና HLA-A-HMGA1 ውስብስብዎች የወጡ።የፕሮቲን አወቃቀሮች አማካይ የ 100 ns MDS መዋቅርን ይወክላሉ.(E) በHLA-A-H2B እና HLA-A-HMGA1 ውህዶች መካከል ያለው መስተጋብር ከ100 ns በላይ በH2B-HLA ሲሙሌሽን ክትትል ከሚደረግ መስተጋብር ጋር ሲነፃፀር በሁለቱ peptides መካከል ባለው የK ወይም S መስተጋብር።ኮምፕሌክስ /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.የመስቀለኛ መንገድ አገናኞችን ለመገምገም የመነሻ ዋጋ ወደ 3.0 ተቀናብሯል፣ እና ከኤምዲኤስ ≥ 10 ns የሚወስዱ የተወሰኑ መስተጋብሮች ግምት ውስጥ ገብተዋል።የፕሮቲን አወቃቀሮች BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) እና Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) ጥቅሎችን በመጠቀም ታይተዋል።
የHLA-A ሞለኪውሎች በጊዜ ሂደት መረጋጋት (መደበኛ ልዩነት፣ RMSD ወይም መደበኛ መዛባት፣ RMSF) በውስብስቦቹ ውስጥ የ H2B ወይም HMGA1 ፕሮቲኖች መኖር HLA-A እንዲረጋጋ አድርጓል (ምስል 8B፣ ምስል S5)።የHMGA1 ፕሮቲን ከ B2M የ HLA-A ቦታ ጋር በጥብቅ ይጣመራል, ይህም የ HLA-A አሚኖ አሲዶች በHLA-A-HMGA1 ወይም H2B-HLA-A-HMGA1 ውስብስብ (ምስል 8B, ምስል S5) መረጋጋትን ያመጣል.በተለይም የ HLA ቅሪቶች ~ 60-90 እና ~ 180-210 በ H2B (FIG. 8B) ፊት ብዙም ተለዋዋጭ ሆነው ተገኝተዋል።H2B እና HMGA1 ከHLA-A ጋር በH2B-HLA-A-HMGA1 ውስብስብ ከHLA-A ማሰሪያ ከH2B ወይም HMGA1 ብቻ ጋር ሲነፃፀሩ የተሻለ ትስስር አሳይተዋል (ምስል 8C፣D፣ Table S5)።በሃይድሮጂን ትስስር ውስጥ የተካተቱት ቅሪቶች (ኤምዲ ሞዴል ከፍተኛ መኖሪያ ≥ 10 ns) ከ CLMS መስተጋብር ጣቢያዎች (K ወይም S ቀሪዎች) ጋር ይጣጣማሉ ፣ ይህም በ CLMS ተለይተው የሚታወቁ ግንኙነቶች በጣም አስተማማኝ ናቸው ።አስተማማኝነት (ምስል 8E).በCLMS እና MD ሞዴሊንግ ውስጥ፣ የHLA-A ቅሪቶች ከ190-210 እና ከ200-220 የሚጠጉ አሚኖ አሲዶች H2B እና HMGA1ን በቅደም ተከተል ሲያገናኙ (FIG. 8E) ተገኝተዋል።
የፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብር ለተወሰኑ ማነቃቂያዎች ምላሽ በመስጠት የውስጠ-ሴሉላር ግንኙነትን የሚያስተናግዱ ተለዋዋጭ መዋቅራዊ መረቦችን ይመሰርታሉ።ብዙ ፕሮቲዮሚክስ አቀራረቦች በፕሮቲን አጠቃላይ የተረጋጋ ሁኔታ ላይ ለውጦችን ስለሚያገኙ፣ የፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብር ተለዋዋጭነት አስገዳጅ መገናኛዎችን ለመያዝ ተጨማሪ መሣሪያዎችን ይፈልጋል፣ እና CLMS አንዱ የዚህ አይነት መሳሪያ ነው።የኢንተርፌሮን ምልክት ስርዓት ሴሎች ለተለያዩ የአካባቢ በሽታ አምጪ እና ውስጣዊ የፓቶሎጂ ምልክቶች ምላሽ እንዲሰጡ የሚያስችል የሳይቶኪን አውታረመረብ ነው ፣ ይህም የኢንተርፌሮን-ኢንዳክቲቭ ፕሮቲኖች ንዑስ ስብስቦችን በማነሳሳት ያበቃል።አዲስ የፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብር በኢንተርፌሮን-የተፈጠሩ ፕሮቲኖች መካከል ሊታወቅ ይችል እንደሆነ ለማወቅ CLMSን አመልክተናል።ኢንተርፌሮን ምላሽ በሚሰጥ የፍሎ-1 ሴል ሞዴል ውስጥ ያለው ዓለም አቀፍ የፕሮቲን አቋራጭ ትንተና የፕሮቲን ውስብስቦችን ለመያዝ ጥቅም ላይ ውሏል።ከመስቀል-የተገናኙ እና ከተሻገሩ ህዋሶች ውስጥ tryptic peptides ማውጣት የፔፕታይድ ቆጠራን ፣ የመንገድ ማበልፀጊያ እና የፔፕታይድ ርዝመትን ከተወሰነ የ LFQ ጥንካሬ ጋር ለማሰራጨት ያስችላል።ቀኖናዊ ኢንተርፌሮን-ኢንዳክቲቭ ፕሮቲኖች እንደ አወንታዊ የውስጥ ቁጥጥር ተለይተዋል ፣ እንደ MX1 ፣ UP18 ፣ OAS3 እና STAT1 ያሉ አዳዲስ ኢንተርሞለኪውላር እና ኢንትሮሞለኪውላዊ መስቀል-የተገናኙ ቀኖናዊ ኢንተርፌሮን-ኢንዳክቲቭ ፕሮቲኖች ታይተዋል።በተግባራዊ አካባቢዎች የተለያዩ መዋቅራዊ ባህሪያት እና መስተጋብሮች ተፈትተዋል.
በHLA-A፣ MDN1 እና H2B መካከል ያለው መስተጋብር በFlo-1 እና A549 ህዋሶች ውስጥ በክትባት እና በIFNα ባልታከሙ የበሽታ መከላከያ ዘዴዎች ተገኝቷል።ውጤቶቻችን HLA-A ከH2B ጋር በIFNα-ጥገኛ መንገድ እንደሚይዝ ያጎላል።የእኛ ስራ የእነዚህን ሁለት ውስብስቦች የጋራ አከባቢን ለቀጣይ ፍለጋ አስደሳች መንገድን ይወክላል።በተጨማሪም የሴሎች አይነት-ገለልተኛ የኢንተርፌሮን-መካከለኛ የፕሮቲን መስተጋብርን ለመለየት የ CLMS አቀራረብን ወደ ፓነል የሴል መስመሮች ማስፋት አስደሳች ይሆናል.በመጨረሻም፣ በH2BFS-HLA-A-HMGA1 ኮምፕሌክስ ውስጥ የተካተቱትን ፕሮቲኖች የውስጠ-ሞለኪውላር እና ኢንተርሞለኩላር አቋራጭ ንግግሮችን ለመከታተል ኤምዲ ሞዴሊንግ እንደ አማራጭ አቀራረብ ተጠቀምን።ከ CLMS መረጃ የተገኙ ሐሳቦች የH2BFS፣ HLA-A እና HMGA1 ፕሮቲኖች የተለያዩ ቅርጾች ሊኖሩ እንደሚችሉ ይጠቁማሉ።በነዚህ የመትከያ ፕሮቲን ውስብስቶች መካከል ሊኖሩ የሚችሉ የተለያዩ ቅርፆች በ CLMS መረጃ ስብስብ ውስጥ ከታዩት ጋር ተመሳሳይ የሆኑ በርካታ መስተጋብሮችን አሳይተዋል።የእኛ ዘዴ አንዱ ዋና ጥንካሬ እንደ HLA ያሉ ከፍተኛ ፖሊሞፈርፊክ ጂኖችን በቀላሉ መለየት ያስችላል፣ ስለዚህ ለማጥናት አስቸጋሪ የሆኑትን የHLA haplotype-ተኮር ፕሮቲኖች መስተጋብር ማጥናት አስደሳች ይሆናል።አንድ ላይ ስንደመር፣ CLMS በኢንተርፌሮን የሚፈጠሩ የምልክት ኔትወርኮች ያለንን ግንዛቤ ለማስፋት እና በዕጢ ማይክሮ ኤንቨሮንመንት ውስጥ ያሉ ውስብስብ ኢንተርሴሉላር ሲስተሞችን ለማጥናት መሰረት እንደሚሰጡ መረጃዎች ያሳያሉ።
ፍሎ-1 ሴሎች ከ ATCC የተገኙ እና በዲኤምኤም (ጂቢኮ) ውስጥ በ 1% ፔኒሲሊን / ስትሬፕቶማይሲን (ኢንቪትሮጅን), 10% fetal bovine serum (ጊብኮ) እና በ 37 ° ሴ እና 5% CO2 ተጨምረዋል.ኢንኩቤሽንበ IFNα14 (በኤድንበርግ ፕሮቲን ማምረቻ ተቋም የተሰራ) ከመታከሙ በፊት ሴሎች ወደ 70-80% ውህደት አድጓል።ሌላ ካልተጠቀሰ በስተቀር ሁሉም ሌሎች ኬሚካሎች እና ሪጀንቶች ከሲግማ አልድሪች ተገዙ።
የፍሎ-1 ህዋሶች በ6-ጉድጓድ ሳህኖች ውስጥ የሰለጠኑ ሲሆን በሚቀጥለው ቀን ሴሎቹ በ10 ng/ml IFNα14 ለ24 ሰአታት እስከ 80% የሚደርሱ ውህደቶች ታክመዋል።ሴሎች በፒቢኤስ ሶስት ጊዜ ታጥበው አዲስ ከተዘጋጀው DSS (Thermo Fisher Scientific) (በዲኤምኤስኦ ውስጥ የተሟሟት) በፒቢኤስ ውስጥ ለ 5 ደቂቃዎች በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ እስከ 0.5 ሚ.ኤም.የዲኤስኤስ ማቋረጫ ምላሽ በPBS ተተክቷል እና ቀሪው DSS በPBS ውስጥ 20 mM Tris (pH 8.0) በPBS ውስጥ ለ15 ደቂቃ በ37°ሴ በማከል እንዲጠፋ ተደርጓል።ሴሎች በመቧጨር የተሰበሰቡ እና በዝቅተኛ ማያያዣ ቱቦዎች (አክሲጅን) ውስጥ ይሰበሰባሉ.
የሕዋስ እንክብሉ በ 300 μl ዩሪያ ሊሲስ ቋት (8 M urea፣ 0.1 M Tris፣ pH 8.5) ለ 30 ደቂቃ በክፍል ሙቀት ውስጥ አልፎ አልፎ መንቀጥቀጥ ተቀርጿል።ሁሉም የሴንትሪፍግሽን ደረጃዎች በ 14,000 xg በ 8 ° ሴ.ለ 10 ደቂቃዎች የሊዛውን ሴንትሪፉድ እና ከፍተኛውን ወደ አዲስ ቱቦ ያስተላልፉ.የተቀሩት ግልጽ ቅንጣቶች በ 150 μl ውስጥ በሁለተኛው የሊሲስ ቋት (2 M urea, 2% (w / v) SDS (ሶዲየም ዶዴሲል ሰልፌት)) ለ 30 ደቂቃዎች ወይም ከዚያ በላይ ተመሳሳይ የሆነ የውሃ መፍትሄ እስኪገኝ ድረስ ይቀልጣሉ.ሊዛው ለ 20 ደቂቃዎች ማእከላዊ ተደረገለት እና ከመጠን በላይ መጨመር በቀድሞው ደረጃ ላይ ከተገኘው ሊዛት ጋር ተቀላቅሏል.የማይክሮ ፕላት ሂደቶችን በተመለከተ በአምራቹ መመሪያ መሰረት የማይክሮ ቢሲኤ ምርመራ (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) በመጠቀም የፕሮቲን ውህዶች ተገምግመዋል።ናሙናዎቹ በፍጥነት በፈሳሽ ናይትሮጅን ውስጥ ይቀዘቅዛሉ እና በ -80 ° ሴ.
በግምት 100 μg የሚሟሟ ተሻጋሪ ፕሮቲን በቪስኒየቭስኪ እና ሌሎች እንደተገለፀው የተሻሻለ የማጣሪያ ናሙና ዝግጅት ፕሮቶኮል (FASP) በመጠቀም ተሰራ።69 ባጭሩ፣ ፕሮቲኑ ከ200 μl ዩሪያ ቋት (8 M ዩሪያ በ0.1 ሜ ትሪ፣ ፒኤች 8.5)፣ አዙሪት እና በግማሽ ተቆራርጧል።ሁሉም ማዕከላዊ ደረጃዎች በ 14,000 xg በ 25 ° ሴ.የተሻገረው የፕሮቲን ሊዛት የመጀመሪያ አጋማሽ ወደ 10 ኪዳ ማይክሮኮን ሴንትሪፉጋል ማጣሪያ መሳሪያ ከ Ultracel-10 membrane (ሜርክ) ጋር ተላልፏል, ከዚያም በማጣሪያው ላይ ለ 25 ደቂቃዎች ሴንትሪፉግ.ከዚያም የፕሮቲን ሁለተኛ አጋማሽን ወደ ማጣሪያው ይጨምሩ እና ተመሳሳይ እርምጃዎችን ይድገሙት.የፕሮቲን ማገገሚያ የሚከናወነው በዩሪያ ቋት ውስጥ 100 μl 17 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) በመጨመር ነው።ማገገሚያ በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 30 ደቂቃዎች በ 600 ሬልፔኖች በቴርሞሚክስ ላይ ተነሳ.በተጨማሪም, ዓምዱ ሴንትሪፉድ እና የተቀነሰው ተሻጋሪ ፕሮቲን በዩሪያ ቋት ውስጥ 100 μl 50 mM iodoacetamide በመጠቀም አልኪላይትድ ተደርጓል።የአልካላይዜሽን ምላሽ በጨለማ ውስጥ ለ 20 ደቂቃዎች በቤት ሙቀት ውስጥ ተካሂዷል.ዓምዱን አሽከርክር፣ የአምዱን ግድግዳዎች 3 ጊዜ በ100 μl ዩሪያ ቋት ያጠቡ፣ እና ከዚያ ሴንትሪፉል ያድርጉ።ተመሳሳይ ቀዶ ጥገና በ 100 ሚሊ ሜትር 100 ሚሜ አሚዮኒየም ባይካርቦኔት በመጠቀም 3 ጊዜ ተከናውኗል.ትራይፕሲን ከመደረጉ በፊት, የመሰብሰቢያ ቱቦውን በአዲስ ይተኩ.50 ሚሜ አሚዮኒየም ባይካርቦኔት እና 1 µl ትራይፕሲን በትሪፕሲን ቋት (Promega) የተበረዘ የምግብ መፈጨት ቋት ይጨምሩ።የትሪፕሲን እና የፕሮቲን ጥምርታ በ1፡33 አካባቢ ተጠብቆ ቆይቷል፣ እና የምግብ መፈጨት ምላሾች በአንድ ሌሊት በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ እርጥበት ባለው ክፍል ውስጥ እንዲዳብሩ ተደርጓል።የተሻገረው ፔፕታይድ ከማጣሪያው በሴንትሪፍግሽን ለ25 ደቂቃዎች ወጥቷል።የፔፕታይድ ማገገሚያ በ 50 μl 0.5 M NaCl ወደ ማጣሪያው በማከል ተሻሽሏል, ከዚያም ለ 25 ደቂቃዎች ሴንትሪፍግ.
C18 ማይክሮ ስፒን አምዶች (ሃርቫርድ አፓርተማ) በBouchal et al.70 የተገለጸውን ፕሮቶኮል በመከተል ከቀላል ማሻሻያዎች ጋር የተገናኙትን ትራይፕቲክ ፔፕቲዶችን ለማቃለል ያገለግሉ ነበር።በአጭሩ፣ C18 ስፒን አምዶች በሦስት የ0.1% ፎርሚክ አሲድ (ኤፍኤ) በ acetonitrile (AcN) (Merck) እና በሁለት የ0.1% FA ማጠቢያዎች ነቅተዋል።ዓምዱ በ 0.1% FA ለ 15 ደቂቃዎች ተሞልቷል.ናሙናዎችን ወደ ሽክርክሪት አምዶች ይጫኑ እና በ 0.1% FA 3 ጊዜ ይታጠቡ.በ 0.1% ኤፍኤ ውስጥ 50%፣ 80% እና 100% AcN ን በመጠቀም የደረቁ peptides በቅደም ተከተል በደረጃ ቅልመት ተፈትተዋል።ቀሪው ፈሳሽ ሙሉ በሙሉ እስኪጠፋ ድረስ ናሙናዎቹ በSpeedVac Plus concentrator (Eppendorf) ውስጥ ደርቀዋል።የተለቀቁት peptides በ 100 μl 0.08% trifluoroacetic acid በ 2.5% AcN ውስጥ ተፈትተዋል እና ትኩረቶቹ በ NanoDrop 2000 (ቴርሞ ሳይንቲፊክ) ላይ ይለካሉ.በግምት 1 μg የተሻገረ ፔፕታይድ በአንድ ናሙና ውስጥ ወደ LC-MS/MS ስርዓት ገብቷል።
ከኦርቢትራፕ ኤክስፕሎሪስ 480 የጅምላ ስፔክትሮሜትር (ቴርሞ ሳይንቲፊክ) ጋር በተገናኘ በUltiMate 3000 RSLCnano LC ሲስተም (ቴርሞ ሳይንቲፊክ) ላይ የተገናኙ peptides ተለያይተዋል።የተሻገሩ peptides የተሰበሰቡት በ300 μm መታወቂያ፣ 5 ሚሜ ርዝመት ያለው µ-ቅድመ-አምድ C18 መቅረጽ አምድ በC18 PepMap100 sorbent እና 5 μm PepMap sorbent (ቴርሞ ሳይንቲፊክ) የታጨቀ ነው።በ 5 µl/ደቂቃ የተቀመጠውን የፓምፕ ፍሰት 0.08% ትሪፍሎሮአሴቲክ አሲድ በ2.5% AcN ውስጥ ይቀልጣል።በ 2 μm PepMap sorbent (ቴርሞ ሳይንቲፊክ) ተሞልቶ በ 75 μm ውስጣዊ ዲያሜትር እና 150 ሚሜ ርዝመት ያለው የትንታኔ የተዋሃደ የሲሊካ አምድ ላይ ተሻጋሪ ፔፕቲዶች ተለያይተዋል።የሞባይል ደረጃዎች A እና B 0.1% ኤፍኤ በውሃ እና 0.1% ኤፍኤ በአሴቶኒትሪል ውስጥ እንደቅደም ተከተላቸው።ቅልመት በ2.5% B ይጀምራል እና በ90 ደቂቃ ውስጥ በመስመር ወደ 40% B፣ ከዚያም በሚቀጥሉት 2 ደቂቃዎች ወደ 90% B ይጨምራል።የሞባይል ደረጃ ቅንብር በ90% B ለ10 ደቂቃ ተጠብቆ ከዚያ በ2 ደቂቃ ውስጥ በመስመር ወደ 2.5% B ቀንሷል።ዓምዱ ከሚቀጥለው ዑደት በፊት ለ 8 ደቂቃዎች በ 2.5% B ላይ ተስተካክሏል.ከትንታኔው አምድ የወጡ ተሻጋሪ ፔፕቲዶች በ nanoelectrospray ionization (NSI) ምንጭ ionized እና Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific) ውስጥ ገብተዋል።
Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer በአዎንታዊ የውሂብ ትስስር ሁነታ ላይ ይሰራል።ሙሉ ቅኝት በክፍል ሁነታ በ 120,000 ጥራት ከ m/z 350 Th to m/z 2000 Th.የተለመደው የ AGC ዒላማ 300% ላይ ተቀምጧል ከፍተኛው የግቤት ጊዜ 50ms።ለ peptides ሞኖይሶቶፒክ ከፍተኛ ደረጃ ማወቅ ተችሏል።በጣም ጥቂት ቀዳሚዎች ከተገኙ የእገዳው የመዝናኛ መለኪያ ወደ እውነት ተቀናብሯል።የቀዳማዊው ዝቅተኛው ionክ ጥንካሬ ወደ 5.0e3 ተቀናብሯል እና እስከ +8 የሚደርሱ ቅድመ ክፍያዎች በሙከራዎቹ ውስጥ ተካተዋል።
በውሂብ ትስስር ሁነታ በዋና ፍተሻዎች መካከል ያለው የዑደት ጊዜ ወደ 2.5 ሰከንድ ተቀናብሯል።ተለዋዋጭ የጅምላ ማግለል ወደ 20 ሴኮንድ የተቀናበረው የቀዳማዊው ion የመጀመሪያ ክፍልፋይ ከሆነ በኋላ ነው።የቅድሚያ ማግለል መስኮት ወደ 2ኛ ተቀናብሯል።የመደበኛ የግጭት ሃይል አይነት ከቋሚ የግጭት ሃይል ሁነታ ጋር በመረጃ ላይ የተመሰረተ ኤምኤስ/ኤምኤስ ስካን ተመርጧል።የግጭት ኃይል ወደ 30% ተቀናብሯል.የኦርቢትራፕ ውሳኔ ወደ 15,000 እና የ AGC ግብ ወደ 100% ተቀምጧል.ብጁ ከፍተኛው የክትባት ጊዜ ወደ 60 ሚሊሰከንዶች ተቀናብሯል።
የፕሮቲን-ፕሮቲን ኔትወርክን በተያያዙ ናሙናዎች ውስጥ ከመከታተል በፊት ጥሬ ፋይሎቹን በናሙናዎቹ ውስጥ ሊታዩ የሚችሉ peptides/ፕሮቲን ለመለየት MaxQuant ጥቅል (ስሪት 1.6.12.0)26,27 በመጠቀም እንሰራለን።በተጨማሪም፣ ያልተገናኙ የFlo-1 ናሙናዎች ላይ ተመሳሳይ የፕሮቲዮሚክ ትንታኔዎች ተካሂደዋል እና በ IFNα ያልታከሙ።አብሮ የተሰራውን Andromeda27 በመጠቀም የኤምኤስ/ኤምኤስ መረጃ በዩኒፕሮት የሰው ዳታቤዝ (www.uniprot.org) (ኦገስት 12፣ 2020 ተጭኗል፣ 75,093 ግቤቶችን ይዟል) ተፈለገ።ፍለጋው የተካሄደው የኢንዛይም ልዩነት እና የተለያዩ ማሻሻያዎችን (N, Q) እና oxidation (M) ሳይጠቁም ነው.የቅድሚያ የጅምላ መቻቻል በ 20 ፒፒኤም እና የምርት ionዎች በ 0.02 ዳ.የመጀመሪያው እና ከፍተኛው የጅምላ ልዩነት ወደ 10 ፒፒኤም ተቀናብሯል።ከፍተኛው የፔፕታይድ መጠን በ 4600 ዳ ላይ ተቀምጧል እና ተከታታይ ተመሳሳይነት በ 7 እና 25 አሚኖ አሲዶች (AA) መካከል ተቀምጧል.ተጨማሪ የስታቲስቲክስ ትንተና በፐርሴየስ ፕሮግራም (ስሪት 1.6.10.45) ተካሂዷል.የፕሮቲን ይዘት የተሰላው የፕሮቲን ስፔክራል ጥንካሬን (LFQ ጥንካሬ፣ ያልተሰየመ መጠን)27 መደበኛ በማድረግ እና የጥንካሬ እሴቶቹ ወደ Log2 ተለውጠዋል።በፔፕታይድ ጥንካሬ ተለይተው የሚታወቁ የፕሮቲኖች ተዋረዳዊ ስብስቦች የተገነባው በ R (v 4.1.2) ውስጥ ያለውን የፒያትማፕ (v1.0.12) ጥቅል በመጠቀም ነው።የPathway ማበልፀጊያ ትንተና የተካሄደው በ IFNα የታከሙ ፕሮቲኖችን የReacome pathway ዳታቤዝ በመጠቀም ካልታከሙ ናሙናዎች ጋር ሲነፃፀሩ ከአራት እጥፍ በላይ ገብተዋል።
በኤልሲ-ኤምኤስ/ኤምኤስ ክትትል የሚደረግላቸው የላይሲን (ኬ) ወይም የሴሪን (ኤስ) ልዩ ኬሚካላዊ የፕሮቲን ውህዶች አገናኞችን መለየት በስፔክትሮስኮፒክ መለያ ማሽን (ሲም-ኤክስኤል) ለተገናኙት peptides (SIM-XL)29 ነው።በመጀመሪያ፣ ከኢንተርፌሮን ጋር የተገናኘ (IFN) የዲኤንኤ ጉዳት መቋቋም ፊርማ (IRDS) ጂኖች መካከል ሊኖሩ የሚችሉ ግንኙነቶች በፓዳሪያ እና ሌሎች 28 ውስጥ በተገለፀው የIRDS ፕሮቲን መረጃ ስብስብ ተመርምረዋል።ሁሉንም ሁኔታዎች ማጣራት እና የመላው የሰው ልጅ UniProt ድግግሞሾች በስሌት የተጠናከረ ነው፣ ስለዚህ መላው የሰው UniProt ዳታቤዝ (www.uniprot.org) (ኦገስት 12 ቀን 2020 የወረደው፣ 75,093 ግቤቶችን ይዟል) በIFNα የታከሙ ድግግሞሾች።ለከፍተኛ እምነት መስተጋብር ማጣሪያዎች አንዱ።እነዚህ ከፍተኛ ጠቀሜታ ያላቸው መስተጋብሮች በሁሉም ድግግሞሾች እና ሁኔታዎች ውስጥ ተዘርግተው ተፈትነዋል።
በሲም-ኤክስኤል፣ DSS ለመሻገሪያ (XL) ጥቅም ላይ የዋለ ሲሆን የኤክስኤል ክብደት ለውጥ እና የክብደት ለውጥ ወደ 138.06 እና 156.07 በቅደም ተከተል ተቀምጧል።የሚከተሉት አቋራጭ ምላሽ ጣቢያዎች ይቆጠራሉ፡ ኬኬ፣ ኬኤስ እና ኬኤን-TERM፣ ያለ ዘጋቢ ions።ሁለቱም ቅድመ እና ቁርጥራጭ ፒፒኤም ወደ 20 ተቀናብረዋል እና የ Xrea ገደብ ወደ 0.15 ተቀናብሯል።ትራይፕሲን ሙሉ ለሙሉ የተለየ እንደሆነ ተደርጎ ይወሰድ ነበር, እና ከፍተኛ-ኃይል C-trap (HCD) የመከፋፈል ዘዴ ተተግብሯል.የXCorr ተለዋዋጭ ዲቢ ቅነሳ ገደብ እና ለተለዋዋጭ ዲቢ ቅነሳ ዝቅተኛው የ peptides ብዛት ወደ 2.5 እና 2 ተቀናብሯል።ሌሎች መመዘኛዎች፡- የሞኖሶቶፕ ፕሮባቢሊቲ እና ከፍተኛ የአጋጣሚ ነገር መቆራረጥ፣ ቢያንስ 4 AA ቀሪዎች በአንድ ፈትል እና ከፍተኛው የክራንድ ክፍያ እና 3 ከፍተኛ ያመለጡ ክፍፍሎች ናቸው።የተገኘው የተሰፋ 2D ካርታዎች በ(SIM-XL) የተተነተኑ ሲሆን የ xQuest28 ግራፊክ ውክልና የ2D ካርታዎችን ለመገንባት ስራ ላይ ውሏል።በፕሮቲን አወቃቀሮች ላይ የፕሮቲን ማቋረጫዎች በፒሞል (PyMOL Molecular Graphics System, ስሪት 2.0 Schrödinger, LLC) ውስጥ ቀርበዋል.
የፕሮቲን ሞዴል አወቃቀሮች የተፈጠሩት የ Phyre2 አገልጋይ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 በመጠቀም የሆሞሎጂ ሞዴል እና የ "ድብቅ ማርኮቭ ዘዴ" መርሆዎችን በመጠቀም ነው.Phyre2 ከታወቁት የፕሮቲን አወቃቀሮች ጋር በቅደም ተከተል በማስተካከል ሞዴል አወቃቀሮችን ያመነጫል።ለH2BFS፣ HLA-A፣ HMGA1፣ LRCH4 እና MDN1 ፕሮቲኖች፣ የአብነት መዋቅሮች 1kx552፣ 1kj349፣ 2eze55፣ 6hlu62 እና 6i2665 ጥቅም ላይ ውለዋል።በተጨማሪም፣ የ AlphaFold71 MX1፣ UBP18 እና ROBO1 መዋቅር እንዲሁ ግምት ውስጥ ገብቷል።የፕሮቲን አወቃቀሩ የBIOVIA Discovery Studio Visualizer ጥቅል (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) እና የሞለኪውላር ኦፕሬቲንግ ኢንቫይሮንመንት ፓኬጅ (MOE; ኬሚካል ኮምፒውቲንግ ግሩፕ ኢንክ.፣ ሞንትሪያል፣ ኩቤክ፣ ካናዳ) በመጠቀም ታይቷል።