Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ ያለው የአሳሽ ስሪት እየተጠቀሙ ነው።ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)።በተጨማሪም, ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ, ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን.
በእያንዳንዱ ስላይድ ሶስት መጣጥፎችን የሚያሳዩ ተንሸራታቾች።በተንሸራታቾች ውስጥ ለመንቀሳቀስ የኋላ እና ቀጣይ ቁልፎችን ይጠቀሙ ፣ ወይም በእያንዳንዱ ስላይድ ውስጥ ለመንቀሳቀስ በመጨረሻው ላይ ያሉትን የስላይድ መቆጣጠሪያ ቁልፎችን ይጠቀሙ።

317 አይዝጌ ብረት ጥቅል ቱቦ አቅራቢዎች

ከማይዝግ ብረት የተሰራ የኬሚካል ቅንብር ሰንጠረዥ

SPACA6 በአጥቢ እንስሳት የግብረ ሥጋ መራባት ወቅት ለጋሜት ውህደት ወሳኝ የሆነ የወንድ የዘር ፍሬ የተገኘ የገጽታ ፕሮቲን ነው።ምንም እንኳን ይህ መሠረታዊ ሚና ቢኖርም ፣ የ SPACA6 ልዩ ተግባር በደንብ አልተረዳም።የ SPACA6 ኤክስትራሴሉላር ጎራ ክሪስታል መዋቅር በ 2.2 Å ጥራት እናብራራለን፣ ባለ ሁለት ጎራ ፕሮቲን ከባለ አራት ገመድ ጥቅል እና Ig-like β-sandwiches በ quasi-flexible linkers የተዋቀረ ነው።ይህ መዋቅር IZUMO1ን ይመስላል፣ ሌላ ጋሜት ውህድ-የተገናኘ ፕሮቲን፣ SPACA6 እና IZUMO1 የሱፐር ቤተሰብ ከማዳበሪያ ጋር የተገናኙ ፕሮቲኖች መስራች አባላት ያደርጋቸዋል።የ IST ሱፐርፋሚሊ መዋቅራዊ በሆነ መልኩ የሚገለጸው በተጠማዘዘ ባለአራት ሄሊክስ ጥቅል እና በዲሰልፋይድ በተገናኙ የCXXC ጭብጦች ነው።በመዋቅር ላይ የተመሰረተ የአልፋ ፎልድ የሰው ፕሮቲን ፍለጋ የዚህ ሱፐር ቤተሰብ ተጨማሪ ፕሮቲን አባላትን ለይቷል፤በተለይም ከእነዚህ ፕሮቲኖች ውስጥ ብዙዎቹ በጋሜት ውህደት ውስጥ ይሳተፋሉ።የ SPACA6 መዋቅር እና ከሌሎች የ IST ሱፐር ቤተሰብ አባላት ጋር ያለው ግንኙነት ስለ አጥቢ እንስሳት ጋሜት ውህደት እውቀት የጎደለውን አገናኝ ያቀርባል።
እያንዳንዱ የሰው ልጅ ህይወት የሚጀምረው በሁለት የተለያዩ የሃፕሎይድ ጋሜት ነው፡ የአባት ስፐርም እና የእናት እንቁላል።ይህ ስፐርም በሚሊዮን የሚቆጠሩ የወንድ የዘር ህዋሶች በሴት ብልት ትራክት ውስጥ በማለፍ የተለያዩ መሰናክሎችን በማለፍ እና አቅምን የሚያገኙበት ከፍተኛ የምርጫ ሂደት አሸናፊ ሲሆን ይህም የመንቀሳቀስ ችሎታቸውን እና የገጽታ ክፍሎችን ሂደት ያሻሽላል2,3,4.የወንድ የዘር ፍሬ እና ኦኦሳይት እርስ በርሳቸው ቢገናኙም, ሂደቱ ገና አላለቀም.ኦኦሳይት በኩሙለስ ሴሎች ሽፋን እና ዞና ፔሉሲዳ በሚባለው የ glycoprotein barrier የተከበበ ሲሆን በዚህ በኩል የወንድ የዘር ፍሬ ወደ ኦኦሳይት መግባት አለበት።እነዚህን የመጨረሻ መሰናክሎች ለማሸነፍ Spermatozoa የወለል ንጣፎችን ሞለኪውሎች እና ከገለባ ጋር የተገናኙ እና ሚስጥራዊ ኢንዛይሞችን ይጠቀማሉ።እነዚህ ሞለኪውሎች እና ኢንዛይሞች በዋነኛነት በውስጠኛው ሽፋን እና በአክሮሶማል ማትሪክስ ውስጥ ይከማቻሉ እና የወንድ የዘር ፍሬው የውጨኛው ሽፋን በአክሮሶማል ምላሽ ላይ ሲፈስስ6 ነው።በዚህ ከባድ ጉዞ ውስጥ የመጨረሻው እርምጃ የወንድ የዘር ፍሬ-የእንቁላል ውህደት ክስተት ሲሆን ሁለቱ ህዋሶች ሽፋናቸውን በማዋሃድ አንድ ዳይፕሎይድ አካል ይሆናሉ።ምንም እንኳን ይህ ሂደት በሰው ልጅ የመራባት ሂደት ውስጥ ትልቅ ቦታ የሚሰጠው ቢሆንም አስፈላጊው የሞለኪውላር መስተጋብር በደንብ አልተረዳም።
ጋሜትን ከማዳቀል በተጨማሪ የሁለት የሊፕድ ቢላይየሮች ውህደት ኬሚስትሪ በስፋት ጥናት ተደርጎበታል።በአጠቃላይ የሜምፕል ውህደት ሁለት ሽፋኖችን የሚያቀራርበ፣ ቀጣይነታቸውን የሚሰብር እና ውህድ8፣9ን የሚያስከትል የመዋቅር ለውጥ ለማድረግ የፕሮቲን ማነቃቂያን የሚፈልግ በሃይል የማይመች ሂደት ነው።እነዚህ የፕሮቲን ማነቃቂያዎች fusogens በመባል ይታወቃሉ እና ስፍር ቁጥር በሌላቸው የውህደት ስርዓቶች ውስጥ ይገኛሉ።በቫይራል ወደ አስተናጋጅ ሴሎች እንዲገቡ ይፈለጋሉ (ለምሳሌ ጂፒ160 በኤችአይቪ-1 ፣ ኮሮናቫይረስ ውስጥ ስፒክ ፣ ሄማግሉቲኒን በኢንፍሉዌንዛ ቫይረሶች) 10,11,12 placental (syncytin) 13,14,15 እና በታችኛው eukaryotes ውስጥ ጋሜት የሚፈጥሩ ውህዶች ( HAP2/GCS1 በእጽዋት፣ ፕሮቲስቶች እና አርቶፖድስ) 16፣17፣18፣19።ምንም እንኳን በርካታ ፕሮቲኖች ለጋሜት መያያዝ እና ውህደት ወሳኝ እንደሆኑ ቢታወቅም ለሰው ልጅ ጋሜት ፎሶጅን ገና አልተገኙም።የ oocyte-expressed CD9, የመዳፊት እና የሰው ጋሜት ውህደት የሚያስፈልገው transmembrane ፕሮቲን, የመጀመሪያው 21,22,23 ተገኝቷል.ምንም እንኳን ትክክለኛው ተግባሩ ግልፅ ባይሆንም ፣ በማጣበቅ ላይ ያለው ሚና ፣ በእንቁላል ማይክሮቪሊ ላይ ያለው የማጣበቅ ፍላጎት አወቃቀር እና/ወይም የ oocyte ወለል ፕሮቲኖች ትክክለኛ አካባቢያዊነት 24,25,26 ይመስላል።ለጋሜት ውህደት ወሳኝ የሆኑት ሁለቱ በጣም የተለመዱ ፕሮቲኖች የስፐርም ፕሮቲን IZUMO127 እና የ oocyte ፕሮቲን JUNO28 ሲሆኑ የጋራ ማህበራቸው ከመዋሃድ በፊት ጋሜትን ለመለየት እና ለማጣበቅ ወሳኝ እርምጃ ነው።ወንድ Izumo1 ኳታ አዉት አይጥ እና ሴት ጁኖ ኳታዉት አይጥ ሙሉ በሙሉ ንፁህ ናቸው በነዚህ ሞዴሎች የወንድ የዘር ፍሬ ወደ ፔሪቪቴልላይን ቦታ ይገባሉ ነገርግን ጋሜት አይዋሃዱም።በተመሳሳይ መልኩ ጋሜት በፀረ-IZUMO1 ወይም JUNO27,29 ፀረ እንግዳ አካላት በቫይትሮ ማዳበሪያ ሙከራዎች ሲታከሙ ውህደቱ ቀንሷል።
በቅርብ ጊዜ፣ ከIZUMO1 እና JUNO20,30,31,32,33,34,35 ጋር ተመሳሳይ የሆነ የወንድ የዘር ፍሬ-የተገለጹ ፕሮቲኖች ቡድን ተገኘ።ስፐርም acrosomal membrane-associated protein 6 (SPACA6) በትልቅ የ murine mutagenesis ጥናት ውስጥ ለማዳበሪያ አስፈላጊ እንደሆነ ተለይቷል.በ Spaca6 ጂን ውስጥ ትራንስጅን ማስገባት የማይቻሉ ስፐርማቶዞኣዎችን ያመነጫል, ምንም እንኳን እነዚህ የወንድ የዘር ህዋስ (spermatozoa) በፔሪቪቴልላይን ቦታ 36 ውስጥ ዘልቀው ቢገቡም.በአይጦች ውስጥ የተካሄዱት ተከታታይ የድብደባ ጥናቶች Spaca6 ለጋሜት ውህደት 30,32 እንደሚያስፈልግ አረጋግጠዋል።SPACA6 በ testes ውስጥ ማለት ይቻላል ብቻ ተገልጿል እና IZUMO1 ጋር ተመሳሳይ የሆነ ለትርጉም ጥለት ያለው, ማለትም acrosomal ምላሽ በፊት spermatozoa ያለውን intima ውስጥ, እና ከዚያም acrosomal ምላሽ 30,32 በኋላ ወደ ኢኳቶሪያል ክልል ይሰደዳል.Spaca6 homologues በተለያዩ አጥቢ እንስሳት እና ሌሎች eukaryotes 30 ውስጥ ይገኛሉ እና ለሰው ልጅ ጋሜት ውህደት ያለው ጠቀሜታ SPACA6 30ን በመቋቋም በብልቃጥ ውስጥ የሰው ልጅ ማዳበሪያን በመከልከል ታይቷል።ከIZUMO1 እና JUNO በተለየ የ SPACA6 አወቃቀር፣ መስተጋብር እና ተግባር ዝርዝሮች ግልጽ አይደሉም።
በቤተሰብ ምጣኔ እና የወሊድ ህክምና ላይ የወደፊት እድገቶችን ለማሳወቅ የሚያስችለንን የሰው ዘር እና እንቁላል ውህደት መሰረታዊ ሂደትን የበለጠ ለመረዳት SPACA6 መዋቅራዊ እና ባዮኬሚካል ጥናቶችን አካሂደናል.የ SPACA6 የውጭ ሴሉላር ጎራ ክሪስታል መዋቅር ባለአራት-ሄሊካል ጥቅል (4HB) እና ኢሚውኖግሎቡሊን መሰል (Ig-like) በኳሲ-ተለዋዋጭ ክልሎች የተገናኘ ጎራ ያሳያል።በቀደሙት ጥናቶች እንደተተነበየው፣ የ SPACA6 ጎራ መዋቅር ከሰው IZUMO1 ጋር ተመሳሳይ ነው፣ እና ሁለቱ ፕሮቲኖች ያልተለመደ ዘይቤን ይጋራሉ፡ 4HB በሶስት ማዕዘን ቅርጽ ያለው ሄሊካል ወለል እና ጥንድ ዲሰልፋይድ-የተገናኘ CXXC ጭብጦች።አሁን IZUMO1 እና SPACA6 ከጋሜት ውህደት ጋር የተያያዘ ትልቅ፣ መዋቅራዊ ተያያዥነት ያለው የፕሮቲኖች ቤተሰብን እንዲገልጹ እናቀርባለን።ለሱፐር ቤተሰብ ልዩ የሆኑ ባህሪያትን በመጠቀም፣ የዚህን ሱፐር ቤተሰብ ተጨማሪ አባላትን በመለየት፣ በጋሜት ውህደት እና/ወይም ማዳበሪያ ውስጥ የተሳተፉ በርካታ አባላትን በመለየት የአልፋ ፎልድ መዋቅራዊ የሰው ፕሮቲኦም የተሟላ ፍለጋ አደረግን።አሁን ከጋሜት ውህደት ጋር የተቆራኘ የጋራ መዋቅራዊ እጥፋት እና የፕሮቲኖች ሱፐር ቤተሰብ ያለ ይመስላል፣ እና የእኛ መዋቅር የሰው ልጅ ጋሜት ውህደት ዘዴን ሞለኪውላዊ ካርታ ያቀርባል።
SPACA6 አንድ ኤን-የተገናኘ ግላይካን እና ስድስት putative disulfide ቦንዶች ያለው ባለአንድ ማለፊያ ትራንስሜምብራን ፕሮቲን ነው (ምስል S1a እና S2)።የሰውን SPACA6 (ቅሪ 27-246) በድሮስፊላ ኤስ 2 ሴሎች ውስጥ ገለፅን እና ፕሮቲኑን በኒኬል አፊኒቲቲ ፣ cation ልውውጥ እና መጠን ማግለል ክሮሞግራፊ (ምስል S1b) በመጠቀም አፅድተናል።የተጣራው SPACA6 ectodomain በጣም የተረጋጋ እና ተመሳሳይ ነው.የመጠን ማግለል ክሮማቶግራፊን በመጠቀም ከባለብዙ ጎን ብርሃን መበታተን (SEC-MALS) ጋር ተዳምሮ አንድ ከፍተኛ የሞለኪውል ክብደት 26.2 ± 0.5 ኪዳ (ምስል S1c) አሳይቷል።ይህ ከ SPACA6 monomeric ectodomain መጠን ጋር የሚስማማ ነው, ይህም ኦሊጎሜራይዜሽን በማጽዳት ጊዜ እንዳልተከሰተ ያሳያል.በተጨማሪም ክብ ቅርጽ ያለው ዲክሮሪዝም (ሲዲ) ስፔክትሮስኮፒ ከ 51.3 ዲግሪ ሴንቲግሬድ የማቅለጫ ነጥብ ጋር የተደባለቀ α / β መዋቅር አሳይቷል (ምስል S1d, e).የሲዲ ስፔክትራ ዲኮንቮሉሽን 38.6% α-helical እና 15.8% β-stranded elements (ምስል S1d) አሳይቷል።
SPACA6 ectodomain በዘፈቀደ ማትሪክስ ዘር38 በመጠቀም ክሪስታላይዝድ ተደርጓል በዚህም ምክንያት 2.2 Å ጥራት ያለው የውሂብ ስብስብ (ሠንጠረዥ 1 እና ምስል S3)።ቁርሾን መሰረት ያደረገ ሞለኪውላዊ ምትክ እና የኤስኤዲ ፋሲንግ ዳታ ከብሮሚድ መጋለጥ ጋር ውህድ በመጠቀም መዋቅርን ለመወሰን (ሠንጠረዥ 1 እና ምስል S4) የመጨረሻው የተጣራ ሞዴል ቀሪዎችን 27-246 ያካትታል።አወቃቀሩ በሚታወቅበት ጊዜ ምንም የሙከራ ወይም የአልፋ ፎልድ መዋቅሮች አልነበሩም።የ SPACA6 ectodomain መጠን 20 Å × 20 Å × 85 Å ሰባት ሄሊሴስ እና ዘጠኝ β-strands ያቀፈ ሲሆን በስድስት የዲሰልፋይድ ቦንዶች የተረጋገጠ የተራዘመ የሶስተኛ ደረጃ እጥፋት አለው (ምስል 1 ሀ, ለ).በAsn243 የጎን ሰንሰለት መጨረሻ ላይ ያለው ደካማ የኤሌክትሮን ጥግግት የሚያሳየው ይህ ቅሪት ከኤን-የተገናኘ ግላይኮሲሌሽን ነው።አወቃቀሩ ሁለት ጎራዎችን ያቀፈ ነው፡- N-terminal four-helix bundle (4HB) እና C-terminal Ig-like ጎራ በመካከላቸው መካከለኛ አንጠልጣይ ክልል ያለው (ምስል 1 ሐ)።
የSPACA6 ከሴሉላር ጎራ መዋቅር።የ SPACA6 የውጭ ሴሉላር ጎራ የዝርፊያ ንድፍ፣ የሰንሰለቱ ቀለም ከኤን እስከ ሲ-ተርሚነስ ከጥቁር ሰማያዊ እስከ ጥቁር ቀይ።በዲሰልፋይድ ቦንዶች ውስጥ የሚሳተፉ ሳይስቲንያኖች በማጀንታ ውስጥ ተደምቀዋል።ለ SPACA6 ከሴሉላር ውጭ ያለው ጎራ ቶፖሎጂ።በስእል 1 ሀ እንዳለው ተመሳሳይ የቀለም መርሃ ግብር ተጠቀም።c SPACA6 extracellular domain4HB፣ hinge እና Ig-like ዶሜይን ስትሪፕ ገበታዎች እንደቅደም ተከተላቸው ብርቱካንማ፣ አረንጓዴ እና ሰማያዊ ቀለም አላቸው።ሽፋኖቹ ወደ ሚዛን አልተሳሉም.
የ 4HB የ SPACA6 ጎራ አራት ዋና ዋና ሄልስ (ሄልስ 1-4) ያካትታል, እነሱም በሄሊካል ሄሊክስ (ምስል 2a) መልክ የተደረደሩ, በፀረ-ትይዩ እና በትይዩ መስተጋብሮች መካከል ይቀያየራሉ (ምስል 2 ለ).አንድ ትንሽ ተጨማሪ ነጠላ-ዙር ሄሊክስ (ሄሊክስ 1′) ወደ ቅርቅቡ, perpendicular ተቀምጧል, helices 1 እና 2 ጋር ትሪያንግል ይመሰረታል. ምስል 2 ሀ).
4HB N-ተርሚናል ስትሪፕ ገበታ.ለ አራት ሄልስ ጥቅል ከፍተኛ እይታ፣ እያንዳንዱ ሄሊክስ በN-terminus እና ጥቁር ቀይ በ C-terminus ላይ በጨለማ ሰማያዊ ይደምቃል።ሐ ከላይ ወደ ታች ጠመዝማዛ ጎማ ዲያግራም ለ 4HB፣ እያንዳንዱ ቅሪት ባለ አንድ ፊደል አሚኖ አሲድ ኮድ እንደ ክብ ሆኖ ይታያል።በመንኮራኩሩ አናት ላይ ያሉት አራት አሚኖ አሲዶች ብቻ ተቆጥረዋል ።የዋልታ ያልሆኑ ቅሪቶች ቢጫ ቀለም አላቸው፣ ዋልታ ያልተሞሉ ቅሪቶች አረንጓዴ ቀለም አላቸው፣ በአዎንታዊ ቻርጅ የተደረገ ቅሪቶች ሰማያዊ ቀለም አላቸው፣ እና አሉታዊ የተከሰሱ ቅሪቶች ቀይ ቀለም አላቸው።d የ4HB ጎራ ባለሶስት ማዕዘን ፊቶች፣ 4HB ብርቱካንማ እና ማጠፊያዎች በአረንጓዴ።ሁለቱም ውስጠቶች በዱላ ቅርጽ ያለው የዲሰልፋይድ ቦንዶች ያሳያሉ.
4HB በዋነኛነት በአሊፋቲክ እና ጥሩ መዓዛ ባላቸው ቅሪቶች በተሰራ ውስጣዊ ሃይድሮፎቢክ ኮር ላይ ያተኮረ ነው (ምስል 2 ሐ)።ኮር በሲአይኤስ41 እና በሳይ55 መካከል ያለው የዲሰልፋይድ ቦንድ ይዟል ሄልስ 1 እና 2ን በአንድ ላይ ከፍ ባለ ትሪያንግል የሚያገናኝ (ምስል 2d)።ሁለት ተጨማሪ የዲሰልፋይድ ቦንዶች በCXXC motif በ Helix 1′ እና ሌላ የCXXC ሞቲፍ በማጠፊያው ክልል ውስጥ ባለው β-hairpin ጫፍ ላይ ተገኝቷል (ምስል 2d) መካከል ተፈጠረ።የማይታወቅ ተግባር (Arg37) ያለው ወግ አጥባቂ የአርጊኒን ቅሪት በሄሊስ 1′፣ 1 እና 2 በተሰራው ባዶ ትሪያንግል ውስጥ ይገኛል። አሊፋቲክ የካርቦን አቶሞች Cβ፣ Cγ እና Cδ Arg37 ከሃይድሮፎቢክ ኮር ጋር ይገናኛሉ፣ እና የጓኒዲን ቡድኖቹ ሳይክሎች ይንቀሳቀሳሉ በሄልስ 1' እና 1 መካከል በ Thr32 የጀርባ አጥንት እና የጎን ሰንሰለት መካከል ባለው መስተጋብር (ምስል S5a,b) መካከል.Tyr34 ወደ ጉድጓዱ ውስጥ ይዘልቃል Arg37 ከሟሟ ጋር መስተጋብር የሚፈጥሩ ሁለት ትናንሽ ክፍተቶችን ይተዋል.
Ig-like β-ሳንድዊች ጎራዎች የሁለት ወይም ከዚያ በላይ ባለ ብዙ ባለብዙ-ክር-አምፊፓቲክ β-ሉሆች በሃይድሮፎቢክ ኮር 39 መስተጋብር የሚፈጥሩ ትልቅ የፕሮቲኖች ቤተሰብ ናቸው። እና ሁለት ንብርብሮችን (ምስል S6a) ያካትታል.ሉህ 1 የአራት ክሮች (ክሮች D፣ F፣ H እና I) β-ሉህ ሲሆን ክሮች F፣ H፣ እና ፀረ-ትይዩ ዝግጅትን እፈጥራለሁ፣ እና ክሮች I እና D ትይዩ መስተጋብር ይፈጥራሉ።ሠንጠረዥ 2 ትንሽ ፀረ-ትይዩ ድርብ-ክር ያለው የቅድመ-ይሁንታ ሉህ (ክሮች E እና G) ነው።በ E ሰንሰለት C-terminus እና በ H ሰንሰለት መሃል (Cys170-Cys226) (ምስል S6b) መካከል ያለው ውስጣዊ የዲሰልፋይድ ትስስር ታይቷል.ይህ ዲሰልፋይድ ቦንድ በ β-ሳንድዊች ኢሚውኖግሎቡሊን40,41 ውስጥ ካለው የዲሰልፋይድ ቦንድ ጋር ተመሳሳይ ነው።
ባለአራት ፈትል β-ሉህ በጠቅላላው ርዝመቱ ይሽከረከራል፣ በቅርጽ እና በኤሌክትሮስታቲክስ የሚለያዩ ያልተመጣጠነ ጠርዞችን ይፈጥራል።የቀጭኑ ጠርዝ በSPACA6 (ምስል S6b,c) ውስጥ ካሉት ያልተስተካከሉ እና ኤሌክትሮስታቲካዊ ልዩ ልዩ ንጣፎች ጋር ሲነፃፀር ጎልቶ የሚታይ ጠፍጣፋ ሃይድሮፎቢክ የአካባቢ ወለል ነው።የተጋለጠ የጀርባ አጥንት ካርቦንዳይል/አሚኖ ቡድኖች እና የዋልታ ጎን ሰንሰለቶች የሃይድሮፎቢክ ገጽን ይከብባሉ (ምስል S6c)።ሰፊው ህዳግ የሃይድሮፎቢክ ኮር ኤን-ተርሚናል ክፍልን በሚያግድ እና ሶስት ሃይድሮጂን ቦንድ ከተከፈተው የF ሰንሰለት የጀርባ አጥንት (ምስል S6d) የዋልታ ቡድን ጋር በሚሰራ በተሸፈነ ሄሊካል ክፍል ተሸፍኗል።የዚህ ጠርዝ የ C-terminal ክፍል በከፊል የተጋለጠ የሃይድሮፎቢክ እምብርት ያለው ትልቅ ኪስ ይፈጥራል.ኪሱ በሦስት ስብስቦች ድርብ arginine ቅሪቶች (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 እና Arg212-Arg214) እና ማዕከላዊ histidine (His220) (ምስል S6e) ምክንያት አዎንታዊ ክፍያዎች የተከበበ ነው.
የመታጠፊያው ክልል በሄሊካል ጎራ እና በ Ig-like ጎራ መካከል ያለ አጭር ክፍል ነው፣ እሱም አንድ ተቃራኒ ትይዩ ባለ ሶስት-ክር β-ንብርብር (ክሮች A፣ B እና C)፣ ትንሽ 310 ሄሊክስ እና በርካታ ረጅም የዘፈቀደ ሄሊካል ክፍሎችን ያቀፈ።(ምስል S7).በማጠፊያው ክልል ውስጥ ያለው የኮቫለንት እና ኤሌክትሮስታቲክ ግንኙነቶች አውታረ መረብ በ4HB እና በIg-like ጎራ መካከል ያለውን አቅጣጫ የሚያረጋጋ ይመስላል።አውታረ መረቡ በሦስት ክፍሎች ሊከፈል ይችላል.የመጀመሪያው ክፍል ሁለት የCXXC ጭብጦችን (27CXXC30 እና 139CXXC142) በ β-hairpin በማጠፊያው ውስጥ እና በ 4HB ውስጥ ባለው 1′ ሄሊክስ መካከል ጥንድ ዲሰልፋይድ ቦንድ ይመሰርታሉ።ሁለተኛው ክፍል በ Ig-like ጎራ እና በማጠፊያው መካከል ኤሌክትሮስታቲክ ግንኙነቶችን ያካትታል.በማጠፊያው ውስጥ ያለው ግሉ132 ከ Arg233 በ Ig-like ጎራ እና Arg135 በማጠፊያው ውስጥ ያለው የጨው ድልድይ ይመሰርታል።ሶስተኛው ክፍል በIg-like ጎራ እና በማጠፊያው ክልል መካከል ያለውን የጋራ ትስስር ያካትታል።ሁለት የዲሰልፋይድ ቦንዶች (Cys124-Cys147 እና Cys128-Cys153) የ hinge loopን ወደ ማገናኛ በGln131 እና በጀርባ አጥንት የሚሰራ ቡድን መካከል ባለው ኤሌክትሮስታቲክ መስተጋብር የተረጋጋ ሲሆን ይህም የመጀመሪያውን Ig-like ጎራ ማግኘት ያስችላል።ሰንሰለት.
በፕሮቲን ዳታቤዝ 42 ውስጥ መዋቅራዊ ተመሳሳይ መዝገቦችን ለመፈለግ የ SPACA6 ectodomain አወቃቀር እና የ 4HB እና Ig-like ጎራዎች የግለሰብ መዋቅሮች ጥቅም ላይ ውለዋል.ከፍተኛ የ Dali Z ውጤቶች፣ አነስተኛ መደበኛ ልዩነቶች እና ትልቅ የ LALI ውጤቶች (የኋለኛው መዋቅራዊ ተመጣጣኝ ቀሪዎች ብዛት) ያላቸውን ግጥሚያዎች ለይተናል።ከሙሉ ኢክኮዶሜይን ፍለጋ (ሠንጠረዥ S1) የመጀመሪያዎቹ 10 ምቶች ተቀባይነት ያለው Z-score>842 ሲኖራቸው፣ 4HB ወይም Ig-like ጎራ ፍለጋ ብቻውን እንደሚያሳየው አብዛኛዎቹ እነዚህ ስኬቶች ከ β-ሳንድዊች ጋር ብቻ ይዛመዳሉ።በብዙ ፕሮቲኖች ውስጥ የሚገኝ በሁሉም ቦታ የሚገኝ እጥፋት።በዳሊ ውስጥ ያሉት ሶስቱም ፍለጋዎች አንድ ውጤት ብቻ መልሰዋል፡ IZUMO1።
ከረጅም ጊዜ በፊት SPACA6 እና IZUMO1 መዋቅራዊ ተመሳሳይነቶችን7,32,37 እንደሚጋሩ ተጠቁሟል።ምንም እንኳን የእነዚህ ሁለት ጋሜት ውህደት-የተያያዙ ፕሮቲኖች ecdomains 21% ተከታታይ ማንነትን (ምስል S8a) ብቻ ቢጋሩም ውስብስብ ማስረጃዎች፣ የተጠበቀ የዲሰልፋይድ ቦንድ ንድፍ እና በ SPACA6 ውስጥ የተተነበየ C-terminal Ig-like domainን ጨምሮ ፣የግንባታ የመጀመሪያ ሙከራዎችን ፈቅዷል። IZUMO1 እንደ አብነት37 በመጠቀም የA SPACA6 መዳፊት ሆሞሎጂ ሞዴል።የእኛ መዋቅር እነዚህን ትንበያዎች ያረጋግጣል እና ትክክለኛውን ተመሳሳይነት ደረጃ ያሳያል.እንደ እውነቱ ከሆነ, የ SPACA6 እና IZUMO137,43,44 መዋቅሮች አንድ አይነት ባለ ሁለት-ጎራ አርክቴክቸር (ምስል S8b) ከተመሳሳይ 4HB እና Ig-like β-sandwich ጎራዎች ጋር በማጠፊያ ክልል (ምስል S8c) የተገናኙ ናቸው.
IZUMO1 እና SPACA6 4HB ከተለመዱት ጠመዝማዛ ቅርቅቦች የተለመዱ ልዩነቶች አሏቸው።ዓይነተኛ 4HBs፣ ልክ በ SNARE ፕሮቲን ውህዶች ውስጥ በ endosomal fusion 45,46 ውስጥ እንደተገኙት፣ እኩል ርቀት ያላቸው ሄሊኮች በማዕከላዊው ዘንግ ዙሪያ የማያቋርጥ ኩርባ እንዲኖራቸው ያደርጋሉ። ያልተስተካከለ ማሸጊያ (ምስል S8d)።ጠመዝማዛው ምናልባት በሄልስ 1′፣ 1 እና 2 በተፈጠረው ትሪያንግል የተነሳ በIZUMO1 እና SPACA6 ውስጥ ተጠብቆ የቆየ እና በተመሳሳይ የCXXC ሞቲፍ በሄሊክስ 1′ የተረጋጋ ነው።ነገር ግን፣ በ SPACA6 (ከላይ Cys41 እና Cys55 covalently linking helices 1 and 2) የሚገኘው ተጨማሪ የዲሰልፋይድ ቦንድ በሶስት ማዕዘኑ ጫፍ ላይ ሹል ጫፍን ይፈጥራል፣ SPACA6 ከ IZUMO1 የበለጠ ጠማማ ያደርገዋል።በተጨማሪም, IZUMO1 በ SPACA6 ውስጥ በዚህ ክፍተት መሃል ላይ የሚታየው Arg37 ይጎድለዋል.በአንጻሩ፣ IZUMO1 የበለጠ የተለመደ የሃይድሮፎቢክ ኮር የአሊፋቲክ እና ጥሩ መዓዛ ያላቸው ቀሪዎች አሉት።
IZUMO1 ባለ ሁለት ፈትል እና ባለ አምስት ፈትል β-sheet43 የያዘ Ig-like ጎራ አለው።በ IZUMO1 ውስጥ ያለው ተጨማሪ ፈትል በ SPACA6 ውስጥ ያለውን ጠመዝማዛ ይተካዋል, ይህም ከF strand ጋር በመገናኘት በክር ውስጥ ያለውን የጀርባ አጥንት ሃይድሮጂን ቁርኝት ይገድባል.አስገራሚው የንጽጽር ነጥብ የሁለቱ ፕሮቲኖች Ig-እንደ ጎራዎች የተተነበየው የወለል ክፍያ ነው።የ IZUMO1 ገጽ ከ SPACA6 ወለል የበለጠ አሉታዊ ተሞልቷል።ተጨማሪ ክፍያ ከወንድ የዘር ህዋስ (sperm membrane) ፊት ለፊት ባለው C-terminus አጠገብ ይገኛል.በ SPACA6 ውስጥ, ተመሳሳይ ክልሎች የበለጠ ገለልተኛ ወይም አዎንታዊ ክፍያ (ምስል S8e) ነበሩ.ለምሳሌ, በ SPACA6 ውስጥ የሃይድሮፎቢክ ወለል (ቀጭን ጠርዞች) እና አዎንታዊ የተሞሉ ጉድጓዶች (ሰፊ ጠርዞች) በ IZUMO1 ውስጥ አሉታዊ ተከፍለዋል.
ምንም እንኳን በ IZUMO1 እና SPACA6 መካከል ያለው ግንኙነት እና ሁለተኛ ደረጃ መዋቅራዊ አካላት በጥሩ ሁኔታ የተጠበቁ ቢሆኑም የ Ig-like ጎራዎች መዋቅራዊ አሰላለፍ እንደሚያሳየው ሁለቱ ጎራዎች አንዳቸው ከሌላው ጋር ሲነፃፀሩ በአጠቃላይ አመለካከታቸው ይለያያሉ (ምስል S9)።የ IZUMO1 ጠመዝማዛ ጥቅል ስለ β-ሳንድዊች ጠመዝማዛ ነው ፣ ከዚህ ቀደም የተገለጸውን “boomerang” ቅርፅ ከማዕከላዊው ዘንግ በ 50 ° አካባቢ ይፈጥራል።በተቃራኒው በ SPACA6 ውስጥ ያለው የሂሊካል ጨረር ወደ 10 ° ወደ ተቃራኒው አቅጣጫ ዘንበል ብሎ ነበር.የእነዚህ አቅጣጫዎች ልዩነቶች በእንጥልጥል ክልል ውስጥ ባሉ ልዩነቶች ምክንያት ሊሆኑ ይችላሉ.በአንደኛ ደረጃ ቅደም ተከተል ደረጃ፣ IZUMO1 እና SPACA6 ከሳይስቴይን፣ glycine እና aspartic acid ቅሪቶች በስተቀር በማጠፊያው ላይ ትንሽ ተከታታይ ተመሳሳይነት አላቸው።በውጤቱም, የሃይድሮጂን ቦንዶች እና ኤሌክትሮስታቲክ ኔትወርኮች ሙሉ ለሙሉ የተለያዩ ናቸው.β-sheet ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ክፍሎች በ IZUMO1 እና SPACA6 ይጋራሉ, ምንም እንኳን በ IZUMO1 ውስጥ ያሉት ሰንሰለቶች በጣም ረጅም እና 310 ሄሊክስ (ሄሊክስ 5) ለ SPACA6 ልዩ ነው.እነዚህ ልዩነቶች ለሁለት ተመሳሳይ ተመሳሳይ ፕሮቲኖች የተለያዩ የጎራ አቅጣጫዎችን ያስከትላሉ።
የእኛ የዳሊ አገልጋይ ፍለጋ SPACA6 እና IZUMO1 በፕሮቲን ዳታቤዝ ውስጥ የተከማቹ ሁለቱ በሙከራ የተረጋገጡ ውቅረቶች ብቻ ናቸው ይህ የተለየ 4HB fold (ሠንጠረዥ S1) መሆናቸውን አረጋግጧል።በቅርብ ጊዜ፣ DeepMind (ፊደል/ጉግል) አልፋ ፎልድ፣ የነርቭ ኔትወርክን መሰረት ያደረገ ስርዓት ፈጥሯል፣ የፕሮቲን 3D አወቃቀሮችን ከዋና ቅደም ተከተሎች48 በትክክል መተንበይ ይችላል።የ SPACA6 አወቃቀሩን ከፈታን ብዙም ሳይቆይ የአልፋ ፎልድ ዳታቤዝ ተለቀቀ፣ ይህም በሰው ፕሮቲን ውስጥ 98.5% የሚሆነውን ሁሉንም ፕሮቲኖች የሚሸፍኑ ትንቢታዊ ሞዴሎችን በማቅረብ 48,49።የእኛን የ SPACA6 መዋቅር እንደ የፍለጋ ሞዴል በመጠቀም፣ በአልፋ ፎልድ የሰው ፕሮቲን ውስጥ ያለውን ሞዴል ለማግኘት የተደረገው መዋቅራዊ homology ከ SPACA6 እና IZUMO1 ጋር መዋቅራዊ ተመሳሳይነት ያላቸውን እጩዎች ለይቷል።SPACA6 (ምስል S10a) -በተለይ 1.1 Årm ectodomainን ከተፈታው መዋቅራችን (ምስል S10b) ጋር በማነፃፀር የአልፋ ፎልድ አስደናቂ ትክክለኛነትን ከግምት ውስጥ በማስገባት የታወቁት የ SPACA6 ግጥሚያዎች ትክክለኛ ሊሆኑ እንደሚችሉ እርግጠኞች መሆን እንችላለን።
ከዚህ ቀደም PSI-BLAST የIZUMO1 ክላስተርን ከሌሎች ስፐርም ጋር የተገናኙ ፕሮቲኖችን ፈልጎታል፡ IZUMO2፣ IZUMO3 እና IZUMO450።አልፋ ፎልድ እነዚህ የIZUMO ቤተሰብ ፕሮቲኖች ከIZUMO1 (ምስል 3a እና S11) ጋር ተመሳሳይ የሆነ የዲስልፋይድ ቦንድ ንድፍ ወደ 4HB ጎራ እንደሚታጠፉ ተንብዮአል፣ ምንም እንኳን Ig የሚመስል ጎራ ባይኖራቸውም።IZUMO2 እና IZUMO3 ከ IZUMO1 ጋር ተመሳሳይነት ያለው ባለ አንድ ጎን ሽፋን ፕሮቲኖች ሲሆኑ IZUMO4 ግን ሚስጥራዊ ይመስላል።በጋሜት ውህደት ውስጥ የ IZUMO 2, 3 እና 4 ፕሮቲኖች ተግባራት አልተወሰኑም.IZUMO3 በ spermatozoa እድገት ወቅት በአክሮሶም ባዮጄኔሲስ ውስጥ ሚና እንደሚጫወት ይታወቃል ፣ እና የ IZUMO ፕሮቲን ውስብስብ 50 ይፈጥራል።በአጥቢ እንስሳት፣ ተሳቢ እንስሳት እና አምፊቢያን ውስጥ ያለው የIZUMO ፕሮቲኖች ጥበቃ እንደሚያመለክተው የእነርሱ እምቅ ተግባራቸው እንደ DCST1/2፣ SOF1 እና FIMP ካሉ ሌሎች የታወቁ ጋሜት-ፊውዥን-ተያያዥ ፕሮቲኖች ጋር የሚጣጣም ነው።
የ IST ሱፐር ቤተሰብ ጎራ አርክቴክቸር ከ4HB፣ hinge እና Ig-like ጎራዎች ጋር በቅደም ተከተል በብርቱካናማ፣ አረንጓዴ እና ሰማያዊ።IZUMO4 ጥቁር የሚመስል ልዩ የ C-terminal ክልል አለው.የተረጋገጠ እና የተለጠፈ ዲሰልፋይድ ቦንዶች በቅደም ተከተል በጠንካራ እና በነጥብ መስመሮች ይታያሉ።b IZUMO1 (PDB፡ 5F4E)፣ SPACA6፣ IZUMO2 (አልፋፎልድ ዲቢ፡ AF-Q6UXV1-F1)፣ IZUMO3 (አልፋፎልድ ዲቢ፡ AF-Q5VZ72-F1)፣ IZUMO4 (አልፋፎልድ ዲቢ፡ AF-Q1ZYL8-Fold፡ AF-Q1ZYL8-Fold) DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) ልክ እንደ ፓነል A. ዲሰልፋይድ ቦንዶች በማጀንታ ውስጥ ይታያሉ.TMEM95፣ IZUMO2 እና IZUMO3 ትራንስሜምብራን ሄሊስ አይታዩም።
ከIZUMO ፕሮቲን በተለየ፣ ሌሎች የSPACA ፕሮቲኖች (ማለትም፣ SPACA1፣ SPACA3፣ SPACA4፣ SPACA5 እና SPACA9) ከ SPACA6 (ምስል S12) በመዋቅር የተለዩ ናቸው ተብሎ ይታሰባል።SPACA9 ብቻ 4HB አለው፣ነገር ግን ተመሳሳይ ትይዩ ፀረ-ትይዩ አቅጣጫ ወይም ተመሳሳይ የዲሰልፋይድ ቦንድ እንደ SPACA6 እንዲኖረው አይጠበቅም።SPACA1 ብቻ ተመሳሳይ Ig-like ጎራ አለው።AlphaFold SPACA3፣ SPACA4 እና SPACA5 ከ SPACA6 ፈጽሞ የተለየ መዋቅር እንዳላቸው ይተነብያል።የሚገርመው፣ SPACA4 በማዳበሪያ ውስጥ ሚና እንደሚጫወት ይታወቃል፣ ነገር ግን ከ SPACA6 በበለጠ መጠን፣ ይልቁንም በወንድ ዘር እና oocyte zona pellucida52 መካከል ያለውን ግንኙነት በማመቻቸት።
የእኛ የአልፋ ፎልድ ፍለጋ ለIZUMO1 እና SPACA6 4HB፣ TMEM95 ሌላ ተዛማጅ አግኝቷል።TMEM95፣ አንድ ነጠላ ስፐርም-ተኮር ትራንስሜምብራን ፕሮቲን፣ የወንዶች አይጦች 32,33 ሲወገዱ መሃን እንዲሆኑ ያደርጋል።TMEM95 የሌለው ስፐርማቶዞኣ መደበኛው ሞርፎሎጂ፣ ተንቀሳቃሽነት እና ወደ ዞን ፔሉሲዳ የመግባት እና ከእንቁላል ሽፋን ጋር የመተሳሰር ችሎታ ነበረው፣ ነገር ግን ከኦሳይት ሽፋን ጋር መቀላቀል አልቻለም።ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች TMEM95 ከ IZUMO133 ጋር መዋቅራዊ ተመሳሳይነቶችን እንደሚጋራ አሳይተዋል።በእርግጥ፣ የአልፋ ፎልድ ሞዴል TMEM95 እንደ IZUMO1 እና SPACA6 ተመሳሳይ የCXXC ጭብጦች ያለው 4HB እና በ SPACA6 (ምስል 3a እና S11) ውስጥ በ helices 1 እና 2 መካከል ያለው ተመሳሳይ ተጨማሪ የዲሰልፋይድ ትስስር ያለው 4HB መሆኑን አረጋግጧል።ምንም እንኳን TMEM95 Ig-like ጎራ ባይኖረውም፣ ከ SPACA6 እና IZUMO1 hinge ክልሎች ጋር ተመሳሳይ የሆነ የዲሰልፋይድ ቦንድ ንድፍ ያለው ክልል አለው (ምስል 3 ለ)።ይህ የእጅ ጽሑፍ በሚታተምበት ጊዜ የቅድመ-ህትመት አገልጋዩ የTMEM95 መዋቅርን ሪፖርት አድርጓል፣ ይህም የአልፋ ፎልድ53 ውጤቱን አረጋግጧል።TMEM95 ከ SPACA6 እና IZUMO1 ጋር በጣም ተመሳሳይ ነው እና በዝግመተ ለውጥ አስቀድሞ በአምፊቢያን (ምስል 4 እና S13) ተጠብቆ ይገኛል።
የ PSI-BLAST ፍለጋ NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP እና SOF1 የውሂብ ጎታዎች እነዚህን ቅደም ተከተሎች በህይወት ዛፍ ውስጥ ያለውን ቦታ ለመወሰን ተጠቅሟል.በቅርንጫፍ ነጥቦች መካከል ያለው ርቀት ወደ ሚዛን አይታይም.
በ SPACA6 እና IZUMO1 መካከል ያለው አስደናቂ አጠቃላይ መዋቅራዊ ተመሳሳይነት TMEM95 እና IZUMO 2፣ 3 እና 4 ፕሮቲኖችን ያካተተ የተጠበቁ መዋቅራዊ ሱፐርፋሚሊ አባላት መስራቾች መሆናቸውን ይጠቁማል።የታወቁ አባላት: IZUMO1, SPACA6 እና TMEM95.ጥቂት አባላት ብቻ Ig የሚመስሉ ጎራዎች ስላሏቸው፣ የ IST ሱፐር ቤተሰብ መለያ መለያ 4HB ጎራ ነው፣ እሱም ለእነዚህ ሁሉ ፕሮቲኖች የተለመዱ ልዩ ባህሪያት አሉት፡ 1) የተጠቀለለ 4HB በፀረ-ትይዩ/ትይዩ መለዋወጫ (ምስል)። .5ሀ)፣ 2) ጥቅሉ ባለ ሦስት ማዕዘን ፊት በጥቅሉ ውስጥ ሁለት ሄሊሶች እና ሦስተኛው ቀጥ ያለ ሄሊክስ (ምስል ቁልፍ ቦታ (ምስል 5 ሐ)። በቲዮሬዶክሲን በሚመስሉ ፕሮቲኖች ውስጥ የሚገኘው የCXXC ሞቲፍ እንደሚሰራ ይታወቃል። እንደ ሪዶክስ ዳሳሽ 54,55,56, በ IST ቤተሰብ አባላት ውስጥ ያለው ጭብጥ ከፕሮቲን ዳይሰልፋይድ ኢሶሜራሴስ እንደ ERp57 በጋሜት ውህደት ውስጥ ሊገናኝ ይችላል ሚናዎች ከ 57,58 ጋር የተያያዙ ናቸው.
የ IST ሱፐር ቤተሰብ አባላት በ 4HB ጎራ በሶስት ባህሪያት ይገለፃሉ፡ አራት ሄልስ በትይዩ እና በፀረ-ትይዩ አቅጣጫ መካከል እየተፈራረቁ፣ ባ-ትሪያንግል ሄሊካል ጥቅል ፊቶች እና በትንሽ ሞለኪውሎች መካከል የተፈጠረ የ CA CXXC ድርብ ሞቲፍ።) N-terminal helixes (ብርቱካንማ) እና ማጠፊያ ክልል β-hairpin (አረንጓዴ).
በ SPACA6 እና IZUMO1 መካከል ያለውን ተመሳሳይነት ግምት ውስጥ በማስገባት የቀድሞዎቹ ከIZUMO1 ወይም JUNO ጋር የመተሳሰር ችሎታ ተፈትኗል።ባዮላይየር ኢንተርፌሮሜትሪ (BLI) ቀደም ሲል በIZUMO1 እና JUNO መካከል ያለውን መስተጋብር ለመለካት በኪነቲክ ላይ የተመሰረተ የማሰሪያ ዘዴ ነው።የባዮቲን ምልክት የተደረገበት ዳሳሽ ከ IZUMO1 ጋር እንደ ማጥመጃ ከፍተኛ የ JUNO analyte ማጥመጃው ከተፈጠረ በኋላ ጠንካራ ምልክት ተገኝቷል (ምስል S14a) ይህም ከሴንሰሩ ጫፍ ጋር ተያይዞ ባለው የባዮሜትሪ ውፍረት ላይ አስገዳጅ ለውጥ ያሳያል።ተመሳሳይ ምልክቶች (ማለትም፣ JUNO ከዳሳሹ ጋር በIZUMO1 analyte ላይ ማጥመጃ) (ምስል S14b)።SPACA6 እንደ ዳሳሽ-ታሰረ IZUMO1 ወይም ሴንሰር-የተሳሰረ JUNO (ምስል S14a,b) ላይ እንደ ትንታኔ ጥቅም ላይ ሲውል ምንም ምልክት አልተገኘም።የዚህ ምልክት አለመኖር የሚያመለክተው የ SPACA6 ውጫዊ ክፍል ከ IZUMO1 ወይም JUNO ውጭ ሴሉላር ጎራ ጋር እንደማይገናኝ ያሳያል።
የ BLI ምርመራው በባይት ፕሮቲን ላይ የነጻ የላይሲን ቅሪቶች ባዮቲንላይዜሽን ላይ የተመሰረተ ስለሆነ ይህ ማሻሻያ የላይሲን ቅሪቶች በግንኙነቱ ውስጥ ከተሳተፉ ትስስርን ይከላከላል።በተጨማሪም፣ ከሴንሰሩ ጋር ያለው ግንኙነት የማገናኘት አቅጣጫ ስቴሪክ እንቅፋቶችን ሊፈጥር ይችላል፣ስለዚህ የተለመዱ የመጎተት ሙከራዎች በሪኮምቢናንት SPACA6፣ IZUMO1 እና JUNO ectodomains ላይም ተካሂደዋል።ይህ ቢሆንም፣ SPACA6 በ BLI ሙከራዎች ውስጥ ከሚታየው ጋር የሚጣጣም ምንም አይነት መስተጋብርን የሚያመለክት በ His-tagged IZUMO1 ወይም His-tagged JUNO (Fig. S14c,d) ጋር አልዘነበም።እንደ አወንታዊ ቁጥጥር፣ የJUNO መስተጋብርን His IZUMO1 (ምስል S14e እና S15) ከተሰየመ አረጋግጠናል።
በ SPACA6 እና IZUMO1 መካከል ያለው መዋቅራዊ ተመሳሳይነት ቢኖርም SPACA6 JUNOን ማሰር አለመቻሉ የሚያስገርም አይደለም።የሰው ልጅ IZUMO1 ገጽ ከ JUNO ጋር የሚገናኙ ከ 20 በላይ ቅሪቶች አሉት, ከእያንዳንዱ የሶስቱ ክልሎች ቅሪቶችን ጨምሮ (ምንም እንኳን አብዛኛዎቹ በማጠፊያው ክልል ውስጥ ይገኛሉ) (ምስል S14f).ከእነዚህ ቅሪቶች ውስጥ በ SPACA6 (Glu70) ውስጥ የተቀመጠው አንድ ብቻ ነው።ብዙ የተረፈ ተተኪዎች ኦሪጅናል ባዮኬሚካላዊ ባህሪያቸውን ይዘው ቢቆዩም፣ በ IZUMO1 ውስጥ ያለው አስፈላጊው የ Arg160 ቅሪት በ SPACA6 ውስጥ አሉታዊ በሆነው Asp148 ተተክቷል።ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት በ IZUMO1 ውስጥ ያለው የ Arg160Glu ሚውቴሽን ከJUNO43 ጋር ያለውን ትስስር ሙሉ በሙሉ ያስወግዳል።በተጨማሪም ፣ በ IZUMO1 እና SPACA6 መካከል ያለው የጎራ አቅጣጫ ልዩነት በ SPACA6 (ምስል S14g) ላይ ያለውን ተመጣጣኝ ክልል የ JUNO-ቢንዲንግ ቦታን ወለል በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል።
የ SPACA6 ለጋሜት ውህደት እና ከ IZUMO1 ጋር ተመሳሳይነት ቢኖረውም, SPACA6 ተመጣጣኝ የ JUNO ማሰሪያ ተግባር ያለው አይመስልም.ስለዚህ፣ የእኛን መዋቅራዊ መረጃ በዝግመተ ለውጥ ባዮሎጂ ከሚቀርበው አስፈላጊነት ማስረጃ ጋር ለማጣመር ፈልገናል።የ SPACA6 ግብረ-ሰዶማዊነት ቅደም ተከተል ከአጥቢ ​​እንስሳት ባሻገር ያለውን የጋራ መዋቅር ጥበቃ ያሳያል.ለምሳሌ የሳይስቴይን ቅሪቶች ከሩቅ ተዛማጅ አምፊቢያን ውስጥም ይገኛሉ (ምስል 6 ሀ)።የConSurf አገልጋይን በመጠቀም፣ በርካታ ተከታታይ አሰላለፍ ማቆየት ውሂብ 66 ተከታታይ ወደ SPACA6 ወለል ተቀርጿል።ይህ ዓይነቱ ትንተና በፕሮቲን ዝግመተ ለውጥ ወቅት የትኞቹ ቅሪቶች እንደተጠበቁ እና የትኛዎቹ የወለል ንጣፎች በተግባር ላይ እንደሚጫወቱ ያሳያል።
CLUSTAL OMEGA በመጠቀም የተዘጋጀው ከ12 የተለያዩ ዝርያዎች የ SPACA6 ectodomains ተከታታይ አሰላለፍ።በኮንሰርፍ ትንታኔ መሰረት በጣም ወግ አጥባቂ ቦታዎች በሰማያዊ ምልክት ተደርጎባቸዋል።የሳይስቴይን ቅሪቶች በቀይ ተደምቀዋል።የጎራ ድንበሮች እና የሁለተኛ ደረጃ መዋቅር አካላት በአሰላለፉ አናት ላይ ይታያሉ፣ ቀስቶች β-strands እና ሞገዶች ሄሊስን ያመለክታሉ።ቅደም ተከተሎችን የያዙት የNCBI መዳረሻ መለያዎች፡ ሰው (ሆሞ ሳፒየንስ፣ NP_001303901)፣ ማንድሪል (ማንድሪለስ ሉኮፋየስ፣ ኤክስፒ_011821277)፣ ካፑቺን ጦጣ (ሴቡስ ሚሚክ፣ ኤክስፒ_017359366)፣ ፈረስ (Equus002352) 23 XP_032_034)), በግ (ኦቪስ አሪስ፣ ኤክስፒ_014955560)፣ ዝሆን (ሎክሶዶንታ አፍሪካ፣ ኤክስፒ_010585293)፣ ውሻ (ካኒስ ሉፐስ ፋሚሊስ፣ ኤክስፒ_025277208)፣ አይጥ (ሙስ musculus፣ NP_001156381)፣ ታዝማኒያ ዲያብሎስ ሃርል (31381) , 8) ፣ 61_89 እና Bullfrog (Bufo bufo ፣ XP_040282113)።ቁጥሩ በሰዎች ቅደም ተከተል ላይ የተመሰረተ ነው.b የ SPACA6 መዋቅር የላይኛው 4HB እና ከታች Ig-like ጎራ ያለው የገጽታ ውክልና፣ ቀለሞች ከConSurf አገልጋይ ጥበቃ ግምቶች።በጣም የተሻሉ የተጠበቁ ክፍሎች በሰማያዊ, በመጠኑ የተጠበቁ ክፍሎች ነጭ ናቸው, እና በትንሹ የተጠበቁ ቢጫዎች ናቸው.ሐምራዊ ሳይስቲን.ከፍተኛ የጥበቃ ደረጃን የሚያሳዩ ሶስት የወለል ንጣፎች 1፣ 2 እና 3 በተሰየሙት ማስገቢያ ውስጥ ይታያሉ። 4HB ካርቱን በቀኝ በኩል ባለው ማስገቢያ ውስጥ ይታያል (ተመሳሳይ የቀለም መርሃ ግብር)።
የ SPACA6 መዋቅር ሶስት በጣም የተጠበቁ የወለል ክልሎች አሉት (ምስል 6 ለ)።ጠጋኝ 1 4HB እና የመታጠፊያ ክልልን ይሸፍናል እና ሁለት የተጠበቁ የCXXC ዳይሰልፋይድ ድልድዮች፣ Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 ማጠፊያ አውታረ መረብ (ምስል ኤስ 7) እና ሶስት የተጠበቁ ውጫዊ መዓዛ ቅሪቶች (Phe31፣ Tyr73፣ Phe137) ይዟል።የ Ig-like ዶሜይን (ምስል S6e) ሰፊ ጠርዝ፣ ይህም በወንዱ ዘር ወለል ላይ ብዙ አዎንታዊ የተሞሉ ቅሪቶችን ይወክላል።የሚገርመው፣ ይህ ፕላስተር ከዚህ ቀደም በSPACA6 30 ተግባር ላይ ጣልቃ እንደሚገባ የታየ ፀረ እንግዳ አካል ኤፒቶፕ ይዟል።ክልል 3 ማጠፊያውን እና የ Ig-like ጎራ አንድ ጎን ይሸፍናል;ይህ ክልል የተጠበቁ ፕሮላይንሶች (Pro126፣ Pro127፣ Pro150፣ Pro154) እና ወደ ውጭ የሚመለከቱ የዋልታ/የተከሰሱ ቅሪቶችን ይዟል።የሚገርመው ነገር፣ በ4HB ላይ ያሉት አብዛኛዎቹ ቅሪቶች በጣም ተለዋዋጭ ናቸው (ምስል 6 ለ)፣ ምንም እንኳን እጥፉ በ SPACA6 homologue (በሃይድሮፎቢክ ጥቅል ኮር conservatism እንደሚለው) እና ከ IST ሱፐርፋሚሊ ባሻገር የተጠበቀ ቢሆንም።
ምንም እንኳን ይህ በ SPACA6 ውስጥ በትንሹ ሊታዩ ከሚችሉት ሁለተኛ ደረጃ መዋቅራዊ አካላት ጋር በ SPACA6 ውስጥ በጣም ትንሹ ክልል ቢሆንም ፣ ብዙ የማጠፊያ ክልል ቅሪቶች (ክልል 3ን ጨምሮ) በ SPACA6 homologues መካከል በጣም የተጠበቁ ናቸው ፣ ይህ ምናልባት የሄሊካል ጥቅል እና β-ሳንድዊች አቅጣጫ ሚና እንደሚጫወቱ ሊያመለክት ይችላል።እንደ ወግ አጥባቂ.ይሁን እንጂ በ SPACA6 እና IZUMO1 ማጠፊያ ክልል ውስጥ ሰፊ የሃይድሮጂን ትስስር እና ኤሌክትሮስታቲክ ኔትወርኮች ቢኖሩም፣ የውስጣዊ ተለዋዋጭነት ማስረጃ በIZUMO137,43,44 በርካታ የተፈቀዱ መዋቅሮች አሰላለፍ ላይ ይታያል።የነጠላ ጎራዎች አሰላለፍ በጥሩ ሁኔታ ተደራራቢ ቢሆንም የጎራዎቹ አቅጣጫ አንጻራዊ በሆነ መልኩ ከማዕከላዊው ዘንግ ከ50° እስከ 70° ድረስ ይለያያል (ምስል S16)።በመፍትሔው ውስጥ የ SPACA6 ተዛማች ተለዋዋጭ ሁኔታዎችን ለመረዳት የ SAXS ሙከራዎች ተካሂደዋል (ምስል S17a,b).የ SPACA6 ectodomain ን እንደገና መገንባት በዱላ ክሪስታል መዋቅር (ምስል S18) ተስማምቷል, ምንም እንኳን የ Kratky ሴራ በተወሰነ ደረጃ ተለዋዋጭነት (ምስል S17b) ቢያሳይም.ይህ መስተጋብር ከ IZUMO1 ጋር ይቃረናል፣ በዚህ ውስጥ ያልታሰረ ፕሮቲን የቡሜራንግ ቅርፅን በጥልፍ ውስጥም ሆነ በመፍትሔው43 ውስጥ ይይዛል።
ተለዋዋጭውን ክልል ለይቶ ለማወቅ, የሃይድሮጂን-ዲዩተሪየም ልውውጥ የጅምላ ስፔክትሮስኮፒ (H-DXMS) በ SPACA6 ላይ እና ቀደም ሲል በ IZUMO143 (ምስል 7a,b) ላይ ከተገኘው መረጃ ጋር ሲነጻጸር.ከ 100,000 ሰከንድ ልውውጥ በኋላ በመላው መዋቅሩ ከፍ ያለ የዲዩተርየም ልውውጥ እንደሚያመለክተው SPACA6 ከ IZUMO1 የበለጠ ተለዋዋጭ ነው።በሁለቱም አወቃቀሮች፣ የመታጠፊያው ክልል C-terminal ክፍል ከፍተኛ የልውውጥ ደረጃን ያሳያል፣ይህም ምናልባት እርስ በርስ አንጻራዊ በሆነ መልኩ የ4HB እና Ig-like ጎራዎችን መዞር ያስችላል።የሚገርመው፣ 147CDLPLDCP154 ቀሪዎችን የያዘው የ SPACA6 ማጠፊያው ሲ-ተርሚናል ክፍል 3 (ምስል 6 ለ) በጣም የተጠበቀ ክልል ነው (ምስል 6 ለ)፣ ምናልባትም የኢንተርዶሜይን ተለዋዋጭነት በዝግመተ ለውጥ የተጠበቀ የ SPACA6 ባህሪ መሆኑን ያሳያል።እንደ ተለዋዋጭነት ትንተና, የሲዲ ቴርማል ማቅለጫ መረጃ እንደሚያሳየው SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) ከ IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) ያነሰ የተረጋጋ ነው (ምስል S1e እና S19).
የ SPACA6 እና b IZUMO1 H-DXMS ምስሎች።የመቶኛ ዲዩተሪየም ልውውጥ የሚወሰነው በተጠቀሱት የጊዜ ነጥቦች ላይ ነው.የሃይድሮጂን-ዲዩተሪየም ልውውጥ ደረጃዎች በቀለም ከሰማያዊ (10%) እስከ ቀይ (90%) በቀለም ይገለጣሉ።ጥቁር ሳጥኖች ከፍተኛ ልውውጥ ቦታዎችን ያመለክታሉ.በክሪስታል መዋቅር ውስጥ የታዩት የ4HB፣ hinge እና Ig-like ጎራ ድንበሮች ከዋናው ቅደም ተከተል በላይ ይታያሉ።በ10 ሰ፣ 1000 ሰከንድ እና 100,000 ሰከንድ ያለው የዲዩተሪየም የመለዋወጫ ደረጃዎች በSPACA6 እና IZUMO1 ግልጽ ሞለኪውላዊ ንጣፎች ላይ በተደራረበ የጭረት ሠንጠረዥ ላይ ተቀርፀዋል።ከ 50% በታች የዲዩቴሪየም ልውውጥ ደረጃ ያላቸው የሕንፃዎች ክፍሎች ባለቀለም ነጭ ናቸው።ከ50% የኤች-ዲኤክስኤምኤስ ልውውጥ በላይ ያሉ ቦታዎች በቅልመት ልኬት ቀለም አላቸው።
የ CRISPR/Cas9 እና የመዳፊት ጂን ማንኳኳት የዘረመል ስልቶችን መጠቀም ለወንድ ዘር እና እንቁላል ትስስር እና ውህደት አስፈላጊ የሆኑ በርካታ ምክንያቶችን ለይቶ ለማወቅ አስችሏል።በደንብ ከሚታወቀው የIZUMO1-JUNO እና CD9 መዋቅር መስተጋብር በተጨማሪ አብዛኛዎቹ ፕሮቲኖች ከጋሜት ውህደት ጋር የተያያዙት በመዋቅራዊ እና በተግባራዊነት እንቆቅልሽ ሆነው ይቆያሉ።የ SPACA6 ባዮፊዚካል እና መዋቅራዊ ባህሪ ሌላው በማዳበሪያ ጊዜ የማጣበቅ/ውህድ ሞለኪውላር እንቆቅልሽ ነው።
SPACA6 እና ሌሎች የ IST ሱፐርፋሚሊ አባላት በአጥቢ እንስሳት እንዲሁም በግለሰብ ወፎች፣ ተሳቢ እንስሳት እና አምፊቢያን ውስጥ በጣም የተጠበቁ ይመስላሉ።እንዲያውም በዜብራፊሽ ውስጥ SPACA6 ለማዳቀል እንኳን ያስፈልጋል ተብሎ ይታሰባል 59. ይህ ስርጭት እንደ DCST134, DCST234, FIMP31 እና SOF132 ካሉ ሌሎች የታወቁ የጋሜት ውህደት ፕሮቲኖች ጋር ተመሳሳይ ነው, ይህም እነዚህ ምክንያቶች HAP2 እጥረት አለባቸው (እንዲሁም) GCS1 በመባል የሚታወቁት) ለብዙ ፕሮቲስቶች የካታሊቲክ እንቅስቃሴ ተጠያቂ የሆኑ ፕሮቲኖች።፣ እፅዋት እና አርቶፖድስ።የዳበረ ውህደት ፕሮቲኖች 60, 61. በ SPACA6 እና IZUMO1 መካከል ያለው ጠንካራ መዋቅራዊ ተመሳሳይነት ቢኖርም, ከእነዚህ ፕሮቲኖች ውስጥ አንዱን በኮድ የያዙ ጂኖች መውጋት ለወንድ አይጦች መካንነት አስከትሏል ይህም በጋሜት ውህደት ውስጥ ያሉ ተግባራቶቻቸው የተባዙ አይደሉም።.በይበልጥ በስፋት፣ ለተዋሃደ ውህደት ደረጃ ከሚያስፈልጉት የታወቁት የወንድ ዘር ፕሮቲኖች ውስጥ አንዳቸውም ብዙ አይደሉም።
SPACA6 (እና ሌሎች የ IST superfamily አባላት) በ intergametic junctions ውስጥ ይሳተፋሉ፣ ኢንትራጋሜቲክ ኔትወርኮችን ይመሰርታሉ፣ አስፈላጊ ፕሮቲኖችን ወደ ውህደት ነጥቦች ለመቅጠር፣ ወይም ምናልባትም እንደ ፉሶገንስ ሆነው ይሠሩ እንደሆነ ግልጽ ጥያቄ ነው።በHEK293T ሕዋሳት ውስጥ ያሉ የጋራ መከላከያ ጥናቶች በሙሉ ርዝመት IZUMO1 እና SPACA632 መካከል ያለውን መስተጋብር አሳይተዋል።ነገር ግን፣የእኛ recombinant ectodomains በብልቃጥ ውስጥ መስተጋብር አልፈጠሩም ፣ይህም በኖዳ እና ሌሎች ውስጥ የታዩትን መስተጋብሮች ይጠቁማል።ሁለቱም በግንባታው ውስጥ ተሰርዘዋል (የ IZUMO1 ሳይቶፕላስሚክ ጅራት ያስተውሉ፣ ይህም ለማዳቀል አላስፈላጊ እንደሆነ ታይቷል62)።በአማራጭ፣ IZUMO1 እና/ወይም SPACA6 እኛ በብልቃጥ ውስጥ የማናባዛቸውን እንደ ፊዚዮሎጂያዊ ልዩ ቅርፆች ወይም ሞለኪውላር ኮምፕሌክስ ሌሎች ፕሮቲኖችን የያዙ (የታወቁ ወይም ገና ያልተገኙ) ልዩ አስገዳጅ አካባቢዎችን ሊፈልጉ ይችላሉ።ምንም እንኳን IZUMO1 ectodomain በፔሪቪቴልላይን ክፍተት ውስጥ የወንድ የዘር ህዋስ (spermatozoa) ከእንቁላል ጋር መያያዝን እንደሚያስተላልፍ ቢታመንም የ SPACA6 ectodomain አላማ ግልጽ አይደለም.
የ SPACA6 አወቃቀር በፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብር ውስጥ ሊሳተፉ የሚችሉ በርካታ የተጠበቁ ንጣፎችን ያሳያል።ከሲኤክስኤክስሲ ሞቲፍ (ከላይ የተሰየመው Patch 1) ያለው ተጠብቆ ያለው የመታጠፊያው ክፍል ብዙ ወደ ውጭ የሚመለከቷቸው ጥሩ መዓዛ ያላቸው ቅሪቶች አሉት እነሱም ብዙውን ጊዜ ከሃይድሮፎቢክ እና ከ π-መደራረብ ጋር በባዮሞለኪውሎች መካከል ግንኙነት አላቸው።የ Ig-like ጎራ (ክልል 2) ሰፊ ጎኖች በጣም የተጠበቁ አርግ እና የእሱ ቀሪዎች ያሉት በአዎንታዊ ስሜት የተሞላ ጉድጓድ ይመሰርታሉ, እና በዚህ ክልል ላይ ፀረ እንግዳ አካላት ከዚህ ቀደም ጋሜት ውህድ 30 ን ለመከላከል ጥቅም ላይ ውለዋል.ፀረ እንግዳው መስመራዊ ኤፒቶፕ 212RIRPAQLTHRGTFS225ን ይገነዘባል፣ እሱም ከስድስቱ የአርጊኒን ቀሪዎች ውስጥ ሦስቱ ያሉት እና His220 በጣም የተጠበቁ።አሰራሩ የተበላሸው በነዚህ ልዩ ቅሪቶች ወይም በጠቅላላው ክልል በመዘጋቱ እንደሆነ ግልጽ አይደለም።የዚህ ክፍተት በ β-ሳንድዊች C-terminus አቅራቢያ ያለው ቦታ የሲስ-ግንኙነቶችን ከአጎራባች የዘር ፕሮቲን ጋር ያሳያል, ነገር ግን ከ oocyte ፕሮቲኖች ጋር አይደለም.በተጨማሪም፣ በጣም ተለዋዋጭ የሆነ የፕሮላይን-ሀብታም ታንግግል (ሳይት 3) በማጠፊያው ውስጥ ማቆየት የፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብር ቦታ ሊሆን ይችላል ወይም ምናልባትም በሁለቱ ጎራዎች መካከል የመተጣጠፍ ችሎታን መያዙን ሊያመለክት ይችላል።ለ SPACA6 የማይታወቅ ሚና ፆታ አስፈላጊ ነው።የጋሜት ውህደት.
SPACA6 Ig-like β-sandwichesን ጨምሮ ኢንተርሴሉላር የማጣበቅ ፕሮቲኖች አሉት።ብዙ ተለጣፊ ፕሮቲኖች (ለምሳሌ፣ ካድሪን፣ ኢንቴግሪን፣ adhesins፣ እና IZUMO1) ፕሮቲኖችን ከሴል ሽፋን ወደ አካባቢያቸው ዒላማዎች የሚያራዝሙ አንድ ወይም ከዚያ በላይ β-ሳንድዊች ጎራዎች አሏቸው።የ Ig-like የSPACA6 ጎራ እንዲሁ በ β-sandwiches of adhesion and cohesion ውስጥ በብዛት የሚገኘውን ጭብጥ ይዟል፡ በ β-sandwiches ጫፍ ላይ ያሉ ትይዩ ክሮች ድርብ፣ ሜካኒካል ክላምፕስ66 በመባል ይታወቃሉ።ይህ ዘይቤ በሴሉላር ሴሉላር መስተጋብር ውስጥ ለሚሳተፉ ፕሮቲኖች ጠቃሚ የሆነውን የሻር ሃይሎችን የመቋቋም አቅም እንደሚጨምር ይታመናል።ነገር ግን ይህ ከ adhesins ጋር ተመሳሳይነት ቢኖረውም, በአሁኑ ጊዜ SPACA6 ከእንቁላል ነጭዎች ጋር እንደሚገናኝ የሚያሳይ ምንም ማስረጃ የለም.የ SPACA6 ectodomain ከJUNO ጋር መያያዝ አልቻለም እና SPACA6-የHEK293T ሴሎችን እዚህ ላይ እንደሚታየው ዞን 32 ከሌላቸው ኦሴቲስቶች ጋር እምብዛም አይገናኝም።SPACA6 የመሃል ጋሜቲክ ትስስርን ካቋቋመ፣ እነዚህ መስተጋብሮች ከትርጉም በኋላ ማሻሻያዎችን ወይም በሌሎች የወንድ የዘር ፕሮቲን መረጋጋት ሊፈልጉ ይችላሉ።የኋለኛውን መላምት በመደገፍ የ IZUMO1 ጉድለት ያለበት የወንድ የዘር ህዋስ (spermatozoa) ከ oocytes ጋር ይጣመራል, ይህም ከ IZUMO1 ውጭ ያሉ ሞለኪውሎች በጋሜት መጣበቅ ደረጃ 27 ውስጥ እንደሚሳተፉ ያሳያል.
ብዙ የቫይራል, ሴሉላር እና የእድገት ውህደት ፕሮቲኖች እንደ ፉሶጅን ተግባራቸውን የሚተነብዩ ባህሪያት አሏቸው.ለምሳሌ, የቫይረስ ውህደት glycoproteins (ክፍል I, II እና III) የሃይድሮፎቢክ ፊውዥን peptide ወይም loop በፕሮቲኑ መጨረሻ ላይ ወደ አስተናጋጅ ሽፋን ውስጥ ይገባል.የ IZUMO143 የሃይድሮፊሊቲቲ ካርታ እና የ IST ሱፐርፋሚሊ መዋቅር (የተወሰነ እና የተተነበየ) ምንም ግልጽ የሆነ የሃይድሮፎቢክ ፊውዥን peptide አላሳየም።ስለዚህ፣ በ IST ሱፐርፋሚሊ ውስጥ ያሉ ማንኛቸውም ፕሮቲኖች እንደ ፉሶገንስ የሚሰሩ ከሆነ፣ ይህን የሚያደርጉት ከሌሎች ከሚታወቁ ምሳሌዎች በተለየ መንገድ ነው።
ለማጠቃለል ያህል፣ ከጋሜት ውህደት ጋር የተቆራኙት የ IST ሱፐር ቤተሰብ ፕሮቲኖች ተግባር ተንኮለኛ ምስጢር ሆኖ ይቆያል።የእኛ ተለይቶ የሚታወቀው SPACA6 recombinant ሞለኪውል እና የተፈታ አወቃቀሩ በእነዚህ የጋራ መዋቅሮች መካከል ያለውን ግንኙነት እና በጋሜት ትስስር እና ውህደት ውስጥ ያላቸውን ሚና ለመረዳት ያስችላል።
ከተገመተው የሰው ልጅ SPACA6 ectodomain (NCBI accession number NP_001303901.1; residues 27-246) ጋር የሚዛመደው የዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተል በ Drosophila melanogaster S2 ሕዋሳት ውስጥ ለመግለጽ ኮድን የተመቻቸ እና በቅደም ተከተል ኢንኮዲንግ ኮዛክኖም (ኢውሮፊኖም) ዘረ-መል (ጅን) ቁርጥራጭ ሆኖ ተዋህዷል።፣ የቢፒ ሚስጥራዊ ምልክት እና ተዛማጅ 5′ እና 3′ የሚጨርሱት ለዚህ ጂን ከሊግation-ገለልተኛ ክሎኒንግ ወደ pMT አገላለጽ ቬክተር በፑሮማይሲን (pMT-puro) በተሻሻለው የሜታሎቲዮኔን ፕሮሞተር ላይ ነው።የ pMT-puro ቬክተር የ thrombin cleavage ጣቢያን በ 10x-His C-terminal መለያ (ምስል S2) ይከተላል.
የተረጋጋ የ SPACA6 pMT-puro ቬክተር ወደ D. melanogaster S2 (Gibco) ሕዋሳት ማስተላለፍ ለ IZUMO1 እና JUNO43 ጥቅም ላይ ከዋለ ፕሮቶኮል ጋር ተመሳሳይ ነው.S2 ሴሎች ቀልጠው በሼናይደር መካከለኛ (ጊብኮ) ተጨምረው በ10% (v/v) የሙቀት-የማይነቃ የፅንስ ጥጃ ሴረም (ጊብኮ) እና 1X አንቲማይኮቲክ አንቲባዮቲክ (ጊብኮ) ተጨምረዋል።ቀደምት ማለፊያ ሴሎች (3.0 x 106 ሴሎች) በ6-ዌልድ ፕሌትስ (ኮርኒንግ) በግለሰብ ጉድጓዶች ውስጥ ተለጥፈዋል.ከ 24 ሰአታት በኋላ በ 27 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ, ሴሎች በአምራቹ ፕሮቶኮል መሰረት በ 2 mg SPACA6 pMT-puro vector እና Effectene transfection reagent (Qiagen) ድብልቅ ተላልፈዋል.የተሸጋገሩ ሴሎች ለ 72 ሰአታት ተወስደዋል እና ከዚያም በ 6 mg / ml ፑሮሚሲን ይሰበሰባሉ.ከዚያም ሴሎች ከተሟላ የሼናይደር መካከለኛ ተለይተው ከሴረም-ነጻ ኢንሴክት-ኤክስፕሬስ መካከለኛ (ሎንዛ) ለትልቅ የፕሮቲን ምርት እንዲገቡ ተደርገዋል።የ 1 ኤል ባች የኤስ 2 ሴል ባህል ወደ 8–10 × 106 ml-1 ህዋሶች በ 2 ኤል አየር አየር የተሞላ ጠፍጣፋ-ታች ፖሊፕፐሊንሊን ኤርለንሜየር ፍላሽ እና ከዚያም በመጨረሻው 500 μM CuSO4 (ሚሊፖሬ ሲግማ) ማምከን እና ንፅህና ተጣራ።ተነሳሳ።የተፈጠሩት ባህሎች በ 27 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ በ 120 ራም / ደቂቃ ውስጥ ለአራት ቀናት ተወስደዋል.
SPACA6 የያዘ ኮንዲሽነር መካከለኛ በሴንትሪፍግሽን በ 5660×g በ 4°ሴ ከዚያም የሴንትራሜት ታንጀንቲያል ፍሰት ማጣሪያ ሲስተም (ፓል ኮርፖሬሽን) ከ10 kDa MWCO ሽፋን ጋር ተለይቷል።SPACA6ን የያዘ የተከማቸ መካከለኛ ወደ 2 ሚሊር ኒ-ኤንቲኤ አጋሮዝ ሙጫ (Qiagen) አምድ ይተግብሩ።የኒ-ኤንቲኤ ሙጫ በ 10 አምድ ጥራዞች (CV) ቋት A ታጥቧል ከዚያም 1 CV of buffer A ታክሏል የመጨረሻው የኢሚድዶል መጠን 50 ሚሜ.SPACA6 ከ 10 ሚሊር ቋት A ጋር ከኢሚድዳዞል ጋር ተጨምሮ እስከ 500 ሚ.ሜ.ገደብ ክፍል thrombin (ሚሊፖሬ ሲግማ) በቀጥታ ወደ ዳያሊስስ ቱቦ (MWCO 12-14 kDa) በ 1 ዩኒት በ mg SPACA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 እና 150 mM NaCl (buffer B) ለዲያሊሲስ ተጨምሯል.) በ 4 ° ሴ ለ 48 ሰአታት.ከዚያም የቲምብሮቢን-የተሰነጠቀ SPACA6 የጨው ክምችትን ለመቀነስ በሶስት እጥፍ ተጨምሯል እና በ 1 ml MonoS 5/50 GL cation exchange አምድ (Cytiva/GE) ላይ ከ10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ጋር ተጭኗል.የ cation መለዋወጫ በ 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, ከዚያም SPACA6 ከ 0 እስከ 500 mm NaCl በ 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 ለ 25 OK ከ 0 እስከ 500 ሚሜ NaCl ባለው ቀጥተኛ ቅልመት ታጥቧል.ከ ion ልውውጥ ክሮማቶግራፊ በኋላ፣ SPACA6 ወደ 1 ሚሊር ያተኮረ እና ከኤንሪክ SEC650 10 x 300 አምድ (ባዮራድ) ከ ቋት B ጋር የተመጣጠነ በሆነ መልኩ የተገኘ ሲሆን በክሮማቶግራም መሠረት SPACA6 የያዙ ገንዳ እና የማጎሪያ ክፍልፋዮች።ንፅህና በ 16% SDS-polyacrylamide gel ላይ በ Coomassie-stained electrophoresis ተቆጣጠረ።የቢራ-ላምበርት ህግ እና የቲዎሬቲካል ሞላር መጥፋት ቅንጅትን በመጠቀም የፕሮቲን ትኩረትን በ280 nm በመምጠጥ ይለካል።
የተጣራ SPACA6 በአንድ ጀንበር በ10 ሚሜ ሶዲየም ፎስፌት ፣ ፒኤች 7.4 እና 150 ሚሜ ናኤፍ ላይ ተመርምሮ ወደ 0.16 mg/mL በሲዲ ስፔክትሮስኮፒ ተበርዟል።ከ 185 እስከ 260 nm የሞገድ ርዝመት ያለው የሲዲዎች ስፔክተራል ቅኝት በ Jasco J-1500 spectropolarimeter ላይ በ quartz cuvettes በ 1 ሚሜ የኦፕቲካል ጎዳና ርዝመት (ሄልማ) በ 25 ° ሴ በ 50 nm / ደቂቃ.የሲዲ እይታው መነሻ መስመር ተስተካክሏል፣ አማካኝ ከ10 ግዢዎች በላይ ተደረገ እና ወደ አማካኝ ኤሊፕቲቲቲ (θMRE) በዲግሪ ሴሜ2/ዲሞል ተቀይሯል።
MW በዳ ውስጥ የእያንዳንዱ ናሙና ሞለኪውል ክብደት ሲሆን;N የአሚኖ አሲዶች ብዛት ነው;θ በ ሚሊግራም ውስጥ ያለው ኤሊፕቲክ ነው;d በሴሜ ውስጥ ካለው የኦፕቲካል መንገድ ርዝመት ጋር ይዛመዳል;በክፍል ውስጥ የፕሮቲን ትኩረት.