347 12.7 * 1.24 ሚሜ አይዝጌ ብረት የተጠቀለለ ቱቦ ፣ የተመሳሰለ ኤሌክትሮስታቲክ ኮንደንስ ሞለኪውላዊ ዘዴ እና የ α-synuclein እና ታው ውህደት

Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ ያለው የአሳሽ ስሪት እየተጠቀሙ ነው።ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)።በተጨማሪም, ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ, ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን.
በእያንዳንዱ ስላይድ ሶስት መጣጥፎችን የሚያሳዩ ተንሸራታቾች።በተንሸራታቾች ውስጥ ለመንቀሳቀስ የኋላ እና ቀጣይ ቁልፎችን ይጠቀሙ ፣ ወይም በእያንዳንዱ ስላይድ ውስጥ ለመንቀሳቀስ በመጨረሻው ላይ ያሉትን የስላይድ መቆጣጠሪያ ቁልፎችን ይጠቀሙ።

347 አይዝጌ ብረት ቧንቧ ዝርዝር

347 12.7*1.24ሚሜ ከማይዝግ ብረት የተሰራ የተጠቀለለ ቱቦ

የውጪ ዲያሜትር፡ 6.00 ሚሜ OD እስከ 914.4 ሚሜ OD፣ መጠኖች እስከ 24 ኢንች NB ይገኛል የቀድሞ አክሲዮን፣ የኦዲ መጠን የብረት ቱቦዎች የቀድሞ አክሲዮን ይገኛሉ

SS 347 የቧንቧ ውፍረት ክልል: 0.3mm - 50 ሚሜ, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT፡ SCH5S፣ SCH10S፣ SCH40S፣ SCH80S፣ SCH160S፣ ወዘተ (0.5-12ሚሜ) ወይም መደበኛ ያልሆነ መጠን እንደአስፈላጊነቱ እንዲስተካከል

ዓይነት: SS 347 እንከን የለሽ ቧንቧዎች |SS 347 ERW ቧንቧዎች |SS 347 በተበየደው ቧንቧዎች |SS 347 የተሰሩ ቧንቧዎች |SS 347 CDW ቱቦዎች, LSAW ቧንቧዎች / ስፌት በተበየደው / Redrawn

ቅጽ: SS 347 ክብ ቧንቧዎች / ቱቦዎች, SS 347 ካሬ ቧንቧዎች / ቱቦዎች, SS 347 አራት ማዕዘን ቅርጽ ያለው ቧንቧ / ቱቦዎች, SS 347 የተጠቀለሉ ቱቦዎች, SS 347 "U" ቅርጽ, SS 347 የፓን ኬክ ጥቅልሎች, SS 347 የሃይድሮሊክ ቱቦዎች

ርዝመት፡ ነጠላ በዘፈቀደ፣ ድርብ በዘፈቀደ እና የሚፈለግ ርዝመት መጨረሻ፡ ሜዳማ መጨረሻ፣ የታሸገ ጫፍ፣ የተረገጠ

መጨረሻ ጥበቃ: የፕላስቲክ Caps |የውጪ አጨራረስ: 2B, No.4, No.1, No.8 መስታወት ለአይዝጌ ብረት ቧንቧዎች ማጠናቀቅ, እንደ ደንበኛ መስፈርቶች ማጠናቀቅ

የማስረከቢያ ሁኔታ፡- የታሸገ እና የተመረተ፣ የተወለወለ፣ በደማቁ የተሰበረ፣ ቀዝቃዛ የተሳለ

ፍተሻ፣ የፈተና ሪፖርቶች፡ የወፍጮ የሙከራ ሰርተፊኬቶች፣ EN 10204 3.1፣ ኬሚካዊ ሪፖርቶች፣ ሜካኒካል ሪፖርቶች፣ PMI የፈተና ሪፖርቶች፣ የእይታ ቁጥጥር ሪፖርቶች፣ የሶስተኛ ወገን የፍተሻ ሪፖርቶች፣ የ NABL የጸደቀ የላብራቶሪ ሪፖርቶች፣ አጥፊ ሙከራ ሪፖርት፣ አጥፊ ያልሆኑ የፈተና ዘገባዎች

ማሸግ፡- በእንጨት ሣጥኖች፣ በፕላስቲክ ከረጢቶች፣ በብረት ማሰሪያዎች የታሸጉ ወይም በደንበኞች ጥያቄ

ልዩ: መጠኖች እና ዝርዝሮች ከላይ ሌላ በጥያቄ ሊመረቱ ይችላሉ።

SS 347 የቧንቧ መጠን ክልል፡1/2 ኢንች NB፣ OD እስከ 24 ኢንች

ASTM A312 347: እንከን የለሽ እና ቀጥ ያለ ስፌት በተበየደው የኦስቲኒቲክ ፓይፕ ለከፍተኛ ሙቀት እና አጠቃላይ ለመበስበስ አገልግሎት የታሰበ።በመበየድ ጊዜ መሙያ ብረት አይፈቀድም.

ASTM A358 347: የኤሌክትሪክ ውህድ በተበየደው ኦስቲኒቲክ ቱቦ ለቆርቆሮ እና/ወይም ለከፍተኛ ሙቀት አገልግሎት።በተለምዶ ለዚህ መስፈርት እስከ 8 ኢንች የሚደርስ ቧንቧ ብቻ ነው የሚመረተው።በመገጣጠም ጊዜ የመሙያ ብረት መጨመር ይፈቀዳል.

ASTM A790 347፡ እንከን የለሽ እና ቀጥ ያለ ስፌት የተበየደው ፌሪቲክ/አውስቴኒቲክ (ዱፕሌክስ) ፓይፕ ለአጠቃላይ ለመበስበስ አገልግሎት የታሰበ፣ በተለይ የጭንቀት ዝገትን ስንጥቅ መቋቋም ላይ አጽንዖት በመስጠት።

ASTM A409 347: ቀጥ ያለ-ስፌት ወይም ጠመዝማዛ-ስፌት ኤሌክትሪክ ውህድ ትልቅ ዲያሜትር የኦስቲኒቲክ ብርሃን ግድግዳ ቧንቧ ከ14 ኢንች እስከ 30 ኢንች ከግድግዳዎች Sch5S እና Sch 10S ጋር ለመበስበስ እና/ወይም ከፍተኛ

ASTM A376 347: ለከፍተኛ ሙቀት አፕሊኬሽኖች እንከን የለሽ የኦስቲኒቲክ ቧንቧ።

ASTM A813 347: ነጠላ-ስፌት, ነጠላ- ወይም ባለ ሁለት-የተበየደው austenitic ፓይፕ ለከፍተኛ ሙቀት እና ለአጠቃላይ ጎጂ አፕሊኬሽኖች።

ASTM A814 347: ለከፍተኛ ሙቀት እና ለአጠቃላይ የመበስበስ አገልግሎት በብርድ የተሰራ በተበየደው ኦስቲኒቲክ ቱቦ።

347H አይዝጌ ብረት ቧንቧዎች የኬሚካል ቅንብር

አይዝጌ ብረት 347H የቧንቧ ሜካኒካል ባህሪያት

አይዝጌ ብረት 347H ቧንቧዎች አካላዊ ባህሪያት

ለ 347H አይዝጌ ብረት ቧንቧ ተመጣጣኝ ደረጃዎች

የአሚሎይድ አልፋ-ሲንዩክሊን (αS) ድምር የፓርኪንሰን በሽታ እና ሌሎች የሲኑክሊኖፓቲዎች መለያ ምልክት ነው።በቅርብ ጊዜ፣ በተለምዶ ከአልዛይመር በሽታ ጋር የተገናኘው የ tau ፕሮቲን ከ αS ፓቶሎጂ ጋር ተያይዞ በ αS የበለፀጉ ውስጠቶች ውስጥ አብሮ በአካባቢው ተገኝቷል፣ ምንም እንኳን የሁለቱ ፕሮቲኖች ውህደት ሞለኪውላዊ ዘዴ ግልፅ ባይሆንም።እዚህ እንደዘገብን የ αS ደረጃ ወደ ፈሳሽ ኮንዳንስ በኤሌክትሮስታቲክ ኮምፕሌክስ ኮንደንስሽን በኩል በአዎንታዊ ቻርጅ የተደረገባቸው እንደ ታው ባሉ ፖሊፔፕቲዶች።በ αS ለ polycations እና በቫለንስ መሟጠጥ መጠን ላይ በመመስረት የደም መርጋት አውታረመረብ ፣ ክሎቶች በፍጥነት ጄልሽን ወይም ውህደት ይከተላሉ ፣ ከዚያም በቀስታ አሚሎይድ ድምር።የተራቀቁ የባዮፊዚካል ቴክኒኮችን ስብስብ በማጣመር የፈሳሽ-ፈሳሽ αS/ታው ደረጃ መለያየትን መለየት እና በፈሳሽ ፕሮቲን ኮንደንስ ውስጥ ሁለቱንም ፕሮቲኖች የያዙ የተለያዩ ውህዶች እንዲፈጠሩ የሚያደርጉትን ቁልፍ ነገሮች መለየት ችለናል።
ከሽፋን ክፍፍሎች በተጨማሪ በሴሎች ውስጥ የቦታ መለያየት በፕሮቲን የበለፀጉ ፣ፈሳሽ የሚመስሉ ጥቅጥቅ ያሉ ባዮሞሌኩላር ኮንደንስተሮች ወይም ጠብታዎች በሚባሉት ፈሳሽ-ፈሳሽ ደረጃ መለያየት (LLPS) በሚባል ሂደት ሊሳካ ይችላል።እነዚህ ጠብታዎች የሚፈጠሩት በ multivalent ጊዜያዊ መስተጋብር፣ አብዛኛውን ጊዜ በፕሮቲኖች ወይም በፕሮቲን እና በአር ኤን ኤ መካከል ነው፣ እና በሁሉም የኑሮ ስርዓቶች ውስጥ የተለያዩ ተግባራትን ያገለግላሉ።ብዙ ቁጥር ያላቸው የኤልኤልፒ አቅም ያላቸው ፕሮቲኖች በተፈጥሮ ውስጥ በጣም የተዘበራረቁ ዝቅተኛ ውስብስብነት ያላቸው ቅደም ተከተሎችን ያሳያሉ እና ባዮሞሊኩላር ኮንደንስተሮች 3,4,5.ብዙ የሙከራ ጥናቶች እነዚህ ፈሳሽ መሰል ኮንደንስተሮችን የሚያመርቱት የፕሮቲን ተለዋዋጭ፣ ብዙ ጊዜ የተዘበራረቀ እና ሁለገብ ተፈጥሮ አሳይተዋል፣ ምንም እንኳን የእነዚህን ኮንደንስተሮች እድገት እና ብስለት ስለሚቆጣጠሩት ልዩ ሞለኪውላዊ መወሰኛዎች ብዙም የሚታወቅ ነገር ባይኖርም የበለጠ ጠንካራ መሰል ሁኔታ..
አዲሱ መረጃ የተዛባ በፕሮቲን የሚመራ ኤልኤልፒኤስ እና ጠብታዎችን ወደ ጠንካራ መዋቅር መቀየር ተገቢ የሆኑ ሴሉላር መንገዶች ሊሆኑ ይችላሉ የሚለውን መላምት የሚደግፍ ሲሆን ይህም ብዙውን ጊዜ የተበላሹ በሽታዎች መለያ የሆኑትን የማይሟሟ መርዛማ ስብስቦችን ይፈጥራል።ብዙ ከኤልኤልፒኤስ ጋር የተገናኙ የውስጥ ችግር ያለባቸው ፕሮቲኖች (አይዲፒዎች)፣ ብዙውን ጊዜ ከፍተኛ ኃይል የሚሞሉ እና ተለዋዋጭ ናቸው፣ በአሚሎይድ ውህደት ሂደት ከኒውሮዲጄኔሽን ጋር ለረጅም ጊዜ ተያይዘዋል።በተለይም እንደ FUS7 ወይም TDP-438 ያሉ ባዮሞሊኩላር አይዲፒ ኮንደንስቶች ወይም እንደ hnRNPA19 ያሉ ትልቅ ዝቅተኛ ውስብስብነት ያላቸው ፕሮቲኖች ፈሳሽነት በሚባለው ሂደት ጄል መሰል ወይም ጠንካራ ቅርጾች ሆነው ታይተዋል።ድብልቅ.ወደ ጠንካራ ደረጃ ሽግግር (LSPT) እንደ የጊዜ ተግባር ወይም ለተወሰኑ የድህረ-ትርጉም ማሻሻያዎች ወይም ከሥነ-ሕመም ጉልህ ለውጦች1,7.
ሌላው IDP ከኤልኤልፒኤስ ጋር የተያያዘው ታው ከማይክሮቱቡል ጋር የተገናኘ መታወክ ያለበት ፕሮቲን የአሚሎይድ ውህደት በአልዛይመር በሽታ 10 የተጠቃ ቢሆንም በቅርብ ጊዜ በፓርኪንሰን በሽታ (PD) እና ሌሎች የሲናፕቲክ ኑክሌር ፕሮቲኖፓቲዎች 11, 12, 13 ተዛማጅነት አለው.ታው በራሱ በኤሌክትሮስታቲክ መስተጋብር ምክንያት ከመፍትሔ/ሳይቶፕላዝም እንዲለይ ተደርጓል።በተጨማሪም የዚህ ዓይነቱ ልዩ ያልሆነ መስተጋብር በተፈጥሮ ውስጥ ከብዙ ባዮሞሊኩላር ኮንደንስተሮች በስተጀርባ ያለው አንቀሳቃሽ ኃይል እንደሆነ ተስተውሏል15.በታው ፕሮቲኖች ውስጥ ኤሌክትሮስታቲክ ውህደት በቀላል ውህደት ሊፈጠር ይችላል ፣ በዚህ ውስጥ በተቃራኒው ክስ የሚሞሉ የፕሮቲን ክልሎች የመፍቻውን ሂደት ያስከትላሉ ፣ ወይም እንደ አር ኤን ኤ ካሉ አሉታዊ ፖሊመሮች ጋር በመገናኘት ውስብስብ ውህደት በመፍጠር።
በቅርብ ጊዜ, α-synuclein (αS), አሚሎይድ IDP በፒዲ እና ሌሎች በጅምላ synucleinopathy17,18 በመባል የሚታወቁት የነርቭ ዲጄኔሬቲቭ በሽታዎች በሴሉላር እና በእንስሳት ሞዴሎች19,20 ውስጥ በፕሮቲን ኮንቴይነሮች ውስጥ ፈሳሽ መሰል ባህሪ ታይቷል.በብልቃጥ ውስጥ የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት αS ኤልኤልፒኤስን በቀላል ድምር የሚይዘው በዋነኛነት በሃይድሮፎቢክ መስተጋብር ነው፣ ምንም እንኳን ይህ ሂደት ለየት ያለ ከፍተኛ የፕሮቲን ውህዶች እና በተለይም ረጅም የመፈልፈያ ጊዜዎችን ይፈልጋል19,21።Vivo ውስጥ የተስተዋሉት αS የያዙ ኮንደንስተሮች የተፈጠሩት በዚህ ወይም በሌሎች የኤልኤልፒኤስ ሂደቶች አለመሆኑ ቁልፍ ያልተፈታ ጉዳይ ነው።በተመሳሳይ ምንም እንኳን የ αS amyloid aggregation በፒዲ እና በሌሎች synucleinopathies ውስጥ በነርቭ ሴሎች ውስጥ ቢታይም, αS በሴሉላር አሚሎይድ ውህደት ውስጥ የሚያልፍበት ትክክለኛ ዘዴ ግልጽ አይደለም, ምክንያቱም የዚህ ፕሮቲን ከመጠን በላይ መጨመር ይህን ሂደት በራሱ የሚያነሳሳ አይመስልም.ተጨማሪ ሴሉላር መጎዳት ብዙ ጊዜ ያስፈልጋል, ይህም የተወሰኑ ሴሉላር ቦታዎች ወይም ማይክሮኢንቫይረሮች ውስጠ-ህዋሳትን αS አሚሎይድ ስብስቦችን እንደገና ለማደስ እንደሚያስፈልግ ይጠቁማል.አንድ ሴሉላር አካባቢ በተለይ ወደ ውህደት የተጋለጠ የፕሮቲን ኮንደንስ 23 ውስጠኛ ክፍል ሊሆን ይችላል.
የሚገርመው ነገር፣ αS እና tau ከፓርኪንሰን በሽታ እና ከሌሎች synucleinopathies 24,25 ጋር በሰዎች ውስጥ በባህሪያዊ በሽታ መካተት ውስጥ አብረው ሲገኙ እና ሙከራዎች በሁለቱ ፕሮቲኖች መካከል ያለውን የተቀናጀ የፓቶሎጂ ግንኙነት ዘግበዋል 26,27 በመደመር αS እና ታው በኒውሮዲጄኔቲቭ በሽታዎች.ህመም.αS እና ታው በብልቃጥ እና በ vivo 28,29 ውስጥ እርስ በርስ መስተጋብር እና ውህደትን ሲያስተዋውቁ ተገኝተዋል እናም ከእነዚህ ሁለት ፕሮቲኖች የተውጣጡ የተለያዩ ስብስቦች በ synucleinopathies 30 በሽተኞች አእምሮ ውስጥ ተስተውለዋል.ሆኖም ግን፣ በ αS እና tau መካከል ስላለው ግንኙነት እና ስለ አብሮ የመሰብሰቢያው ዘዴ ስለ ሞለኪውላዊ መሠረት ብዙም የሚታወቅ ነገር የለም።αS በከፍተኛ አሉታዊ ኃይል በሚሞላው የC-terminal αS እና በማዕከላዊ ፕሮላይን የበለፀገው የታው ክልል መካከል ባለው ኤሌክትሮስታቲክ መስህብ በኩል ከታው ጋር መስተጋብር እንደሚፈጥር ተዘግቧል።
በዚህ ጥናት ውስጥ, እኛ αS እንደ ፖሊ-ኤል-ላይሲን (pLK) እንደ ፖሊ-ኤል-ላይሲን እንደ ሌሎች አዎንታዊ ክስ polypeptides ጋር ያለውን መስተጋብር በተቃራኒ, ታው ፕሮቲን ፊት, electrostatic ውስብስብ condensation በኩል αS ወደ ጠብታዎች ውስጥ መበታተን እንደሚችል እናሳያለን.αS ለ droplet አውታር እንደ ስካፎልድ ሞለኪውል ሆኖ ይሰራል።በcoacervate አውታረመረብ ውስጥ ከተካተቱት ፕሮቲኖች የቫልነት እና ጥንካሬ ልዩነቶች ጋር የተቆራኙትን ኤሌክትሮስታቲክ αS coacervates በማብሰል ሂደት ውስጥ የሚታዩ ልዩነቶችን ለይተናል።የሚገርመው፣ የ αS እና የ tau amyloid ፕሮቲኖች በረጅም ጊዜ ፈሳሽ coacervates ውስጥ በጋራ ሲዋሃዱ ተመልክተናል እና በእነዚህ ሁለት ፕሮቲኖች ውስጥ ወደ ውህደት የሚመሩ አንዳንድ ቁልፍ ነገሮችን ለይተናል።እዚህ ላይ ይህንን ሂደት በዝርዝር እንገልፃለን, ይህም በበሽታ-ተኮር ውህዶች ውስጥ የሁለት ፕሮቲኖች ኮሎካልላይዜሽን ስር ሊሆን የሚችል ሞለኪውላዊ ዘዴ ነው.
αS በገለልተኛ ፒኤች ላይ በጣም አኒዮኒክ ሲ-ተርሚናል ጅራት አለው (ምስል 1 ሀ) እና ኤልኤልፒኤስን በኤሌክትሮስታቲክ ውህዶች በ polycationic disordered polypeptide ሞለኪውሎች አማካኝነት ሊያልፍ እንደሚችል ገምተናል።በገለልተኛ pH 32 ላይ ባለው አዎንታዊ ቻርጅ እና የተዘበራረቀ ፖሊሜሪክ ተፈጥሮ የተነሳ 100-ቀሪ ፖሊ-ኤል-ላይሲን (pLK) እንደ መነሻ ሞዴል ሞለኪውል ተጠቀምን። በመጀመሪያ፣ pLK ከ αS ሲቲ ጎራ ጋር በ Solution NMR spectroscopy እንደሚገናኝ አረጋግጠናል። (ምስል 1 ለ) በ13C/15N የተሰየመ αS በመጠቀም αS:pLK የሞላር ሬሾዎች ሲኖሩ።pLK ከ Ct-domain αS ጋር ያለው መስተጋብር በኬሚካላዊው ፈረቃ እና በዚህ የፕሮቲን ክልል ውስጥ ከፍተኛ ጥንካሬን በመቀነስ እራሱን ያሳያል።የሚገርመው፣ αSን ከpLK ጋር በአንድ የ αS ክምችት በግምት።5-25 µM ፖሊ polyethylene glycol (5-15% PEG-8) (የተለመደው LLPS ቋት፡ 10 ሚሜ HEPES pH 7.4፣ 100 mM NaCl፣ 15% PEG-8) ወዲያውኑ ሰፊ የፕሮቲን ምስረታ መስክ አለፍን። .ነጠብጣቦች በፍሎረሰንት (WF) እና በብሩህ መስክ (BF) ማይክሮስኮፕ (ምስል 1 ሐ) በመጠቀም ተስተውለዋል.የተጠናከረ αS የያዙ 1-5 µm ጠብታዎች (1 µM AlexaFluor488 የተሰየመ αS ፣ AF488-αS) የኤሌክትሮስታቲክ ንብረታቸው ወደ 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) የመቋቋም ችሎታ እና ለዚያ ካለው ስሜታዊነት ሊገኙ ይችላሉ። የ NaCl ትኩረት መጨመር (ምስል 1 ሐ).የ αS/pLK ኤሌክትሮስታቲክ ኮምፕሌክስ ኮአሰርቬትስ ፈሳሽ መሰል ተፈጥሮ የሚገለጠው በሚሊሰከንዶች ውስጥ የመዋሃድ ችሎታቸው ነው (ምስል 1d)።Turbidimetry ን በመጠቀም በነዚህ ሁኔታዎች ውስጥ የትንፋሽ ጠብታዎች መፈጠርን እንለካለን, ከመረጋጋት ጋር የተያያዘውን ዋና መስተጋብር ኤሌክትሮስታቲክ ተፈጥሮን አረጋግጠናል (ምስል 1e), እና የተለያዩ ፖሊመር ሬሾዎች በ LLPS ሂደት ላይ ያለውን ተጽእኖ ገምግመናል (ምስል 1f).ምንም እንኳን ነጠብጣብ መፈጠር በተለያዩ የፖሊሜር ሬሾዎች ላይ ቢታይም, pLK ከ αS በላይ በሚሆንበት ጊዜ ሂደቱ በጣም ምቹ ነው.በተጨማሪም ኤልኤልፒዎች በኬሚካላዊ የተለያዩ ማፈናቀል ኤጀንት ዴክስትራን-70 (70 ኪዳ) በመጠቀም ወይም የተለያዩ የናሙና ቅርጸቶችን በመጠቀም የመስታወት ስላይድ ጠብታዎችን፣ የተለያዩ ቁሳቁሶችን ማይክሮፕሌት ጉድጓዶችን፣ Eppendorf ወይም quartz capillariesን ጨምሮ ተስተውለዋል።
በዚህ ጥናት ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉ በWT-αS እና ΔCt-αS ልዩነቶች ውስጥ ያሉ የተለያዩ የፕሮቲን ክልሎች ውክልና ውክልና።የአምፊፓቲክ ኤን-ተርሚናል ጎራ፣ ሃይድሮፎቢክ አሚሎይድ-ፎርሚንግ (NAC) ክልል፣ እና አሉታዊ ኃይል ያለው ሲ-ተርሚናል ጎራ በሰማያዊ፣ ብርቱካንማ እና ቀይ በቅደም ተከተል ይታያሉ።የWT-αS የተጣራ ክፍያ በቀሪው (NCPR) ካርታ ይታያል።b NMR የ αS/pLK መስተጋብር የማክሮሞሌክላር ክላምፕስ በሌለበት ሁኔታ ትንተና.pLK ትኩረት ሲጨምር (αS: pLK የሞላር ሬሾዎች 1:0.5, 1:1.5 እና 1:10 በብርሃን አረንጓዴ, አረንጓዴ እና ጥቁር አረንጓዴ, በቅደም ተከተል ይታያሉ).c Coacervate αS/pLK (የሞላር ሬሾ 1፡10) በ25 µM (1 µM AF488-የተሰየመ αS ወይም Atto647N-የተሰየመ pLK ለደብሊውኤፍ ኢሜጂንግ) በኤልኤልፒኤስ ቋት (ከላይ) ወይም በ 500 mM NaCl (ከታች ግራ 0 በኋላ) ወይም ተጨምሯል። % 1,6-hexanediol (1,6-HD፤ ከታች በስተቀኝ)።የመጠን አሞሌ = 20 µmd ተወካይ ጥቃቅን ምስሎች የ BF ነጠብጣብ ውህደት αS/pLK (የሞላር ሬሾ 1:10) በ 25 μM ክምችት;ቀስቶች የግለሰብ ጠብታዎች (ቀይ እና ቢጫ ቀስቶች) ወደ አዲስ ጠብታ (ብርቱካናማ ቀስት) በ 200 ms ውስጥ መቀላቀልን ያመለክታሉ።የመጠን አሞሌ = 20 µmሠ የብርሃን መበተን (በ350 nm) αS/pLK ድምር በኤልኤልፒኤስ ቋት ውስጥ 500 mM NaCl ከመጨመሩ በፊት እና በኋላ ወይም 10% 1,6-HD በ25 µM αS (N = 3 ናሙና ቅጂዎች፣ አማካኝ እና መደበኛ መዛባትም ተጠቁሟል)።f BF ምስል (ከላይ) እና የብርሃን መበታተን ትንተና (በ 350 nm, ታች) የ αS / pLK ውህደት በ 25 μM αS እየጨመረ αS: pLK molar ratio (N = 3 ናሙና ተባዝቷል, አማካይ እና መደበኛ ልዩነትም ይጠቁማል).የመጠን አሞሌ = 10 µmበአንድ ምስል ላይ ያለው የመለኪያ አሞሌ በአንድ ፓነል ውስጥ ያሉትን ሁሉንም ምስሎች ሚዛን ያሳያል።ጥሬ መረጃ የሚቀርበው በጥሬ መረጃ ፋይሎች መልክ ነው።
በ αS/pLK ኤሌክትሮስታቲክ ኮምፕሌክስ ኮንደንስሽን እና ቀደም ሲል αS እንደ ደንበኛ ሞለኪውል ከ tau31 ጋር በቀጥታ በመገናኘት በተመለከትነው ምልከታ፣ αS እና ታው አር ኤን ኤ በሌለበት ከሟሟ ጋር ሊለያዩ እንደሚችሉ ገምተናል። ኮንደንስሽን.በኤሌክትሮስታቲክ ውስብስቦች በኩል፣ እና αS በ αS/ታው coacervates ውስጥ ያለው ስካፎልድ ፕሮቲን ነው (በስእል 2e ውስጥ የ tau ክፍያ ስርጭትን ይመልከቱ)።በ LLPS ቋት ውስጥ 10 μM αS እና 10 μM Tau441 (1 μM AF488-αS እና 1 μM Atto647N-ታውን የያዙ) በ LLPS ቋት ውስጥ ሲቀላቀሉ በቀላሉ ሁለቱንም ፕሮቲኖች የያዙ የፕሮቲን ውህዶችን እንደፈጠሩ ተመልክተናል።(ምስል 2 ሀ)በነጠብጣቦቹ ውስጥ ያሉት ሁለቱ ፕሮቲኖች ኮሎካልላይዜሽን በኮንፊካል (CF) ማይክሮስኮፕ (ተጨማሪ ምስል 1 ሀ) ተረጋግጧል።dextran-70 እንደ ማጠቃለያ ወኪል ጥቅም ላይ ሲውል ተመሳሳይ ባህሪ ታይቷል (ተጨማሪ ምስል 1 ሐ).በFITC የተሰየመ PEG ወይም dextran በመጠቀም፣ ሁለቱም የመጨናነቅ ወኪሎች በናሙናዎቹ ላይ በእኩል መጠን ተከፋፍለው፣ መለያየትም ሆነ ማኅበር (ተጨማሪ ምስል 1d) እንዳያሳዩ ደርሰንበታል።ይልቁንም፣ በዚህ ሥርዓት ውስጥ PEG በሌሎቹ የኤልኤልፒ ሲስተሞች33፣34 እንደሚታየው የተረጋጋ መጨናነቅ ወኪል ስለሆነ፣ በማክሮ ሞለኪውላር መጨናነቅ ውጤቶች የደረጃ መለያየትን እንደሚያበረታቱ ይጠቁማል።እነዚህ በፕሮቲን የበለጸጉ ጠብታዎች ለ NaCl (1 M) ስሜትን የሚነኩ ናቸው ነገር ግን ለ 1,6-HD (10% v/v) አይደሉም፣ ይህም ኤሌክትሮስታቲክ ባህሪያቸውን ያረጋግጣሉ (ተጨማሪ ምስል 2a, b)።የፈሳሽ ባህሪያቸው የሚሊሰከንድ ውህደት ጠብታ ክስተቶችን በቢ ኤፍ ማይክሮስኮፒ በመጠቀም በመመልከት የተረጋገጠ ነው (ምስል 2 ለ)።
የኮንፎካል (CF) ማይክሮስኮፒ ምስሎች αS/Tau441 በኤልኤልፒኤስ ቋት ውስጥ ይተባበራሉ (ከእያንዳንዱ ፕሮቲን 10 μM፣ 0.5 μM የ AF488-የተሰየመ αS እና Atto647N-የተሰየመው Tau441)።b የተወካይ ልዩነት ጣልቃገብነት ንፅፅር (DIC) ምስሎች αS/Tau441 ነጠብጣብ ውህደት ክስተቶች (10 μM ለእያንዳንዱ ፕሮቲን)።የ 50 µM αS በሌለበት (በግራ) ወይም በመገኘት (በስተቀኝ) በ Tau441 LLPS (0-15 µM) የብርሃን መበታተን (በ350 nm) ላይ የተመሰረተ የደረጃ ንድፍ።ሞቃት ቀለሞች የበለጠ መበታተንን ያመለክታሉ.d የብርሃን መበተን የ αS/Tau441 LLPS ናሙናዎች የ αS ትኩረትን በመጨመር (Tau441 በ 5 µM፣ N = 2-3 የናሙና ድግግሞሾች እንደተመለከተው)።ሠ በዚህ ጥናት ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉ አንዳንድ የታው ፕሮቲን ዓይነቶች እና የተለያዩ የፕሮቲን ክልሎች ሥዕላዊ መግለጫ፡- በአሉታዊ ክስ N-terminal domain (ቀይ)፣ በፕሮላይን የበለፀገ ክልል (ሰማያዊ)፣ የማይክሮቱቡል ማሰሪያ ጎራ (ኤምቲቢዲ፣ በብርቱካናማ የደመቀ) እና አሚሎይድ የሚፈጥር ጥንድ ጠመዝማዛ።በኤምቲቢዲ (ግራጫ) ውስጥ የሚገኙ የፋይል ክልሎች (PHF)።የተጣራ ክፍያ በተረፈ (NCPR) የTau441 ካርታ ይታያል።ኤፍ 1 µM AF488 የተሰየመ αS እና Atto647N-የተሰየመውን ΔNt- በመጠቀም፣ 1 µM AF488-labeled αS ወይም ΔCt-αS በመጠቀም ΔNt-Tau (ከላይ፣ 10 µM በአንድ ፕሮቲን) ወይም K18 (ከታች µ ፕሮቲን) ) )) የWF ማይክሮግራፍ በLLPS ወይም K18 ቋት ውስጥ ተጨምሯል።በአንድ ምስል ውስጥ ያሉት የመጠን አሞሌዎች በአንድ ፓነል ውስጥ ያሉትን ሁሉንም ምስሎች ሚዛን ይወክላሉ (20 μm ለፓነሎች a፣ b እና f)።ለፓነሎች c እና d ጥሬ መረጃ እንደ ጥሬ የውሂብ ፋይሎች ቀርቧል።
በዚህ የኤልኤልፒኤስ ሂደት ውስጥ የ αSን ሚና ለመፈተሽ በመጀመሪያ የNaCl (ምስል 2c) ውህዶችን በመጠቀም αS በ droplet መረጋጋት ላይ በኔፊሎሜትሪ ያለውን ተጽእኖ መርምረናል።αS በያዙ ናሙናዎች ውስጥ ያለው የጨው ክምችት ከፍ ባለ መጠን የብርሃን መበታተን እሴቶች (በ 350 nm) ከፍ ያለ ሲሆን ይህም በዚህ የኤልኤልፒኤስ ስርዓት ውስጥ የ αS መረጋጋት ሚና ያሳያል።የ αS ትኩረትን (እና ስለዚህ αS:Tau441 ጥምርታ) ወደ በግምት በመጨመር ተመሳሳይ ውጤት ይታያል።ከtau ትኩረት (5 µM) አንፃር 10 እጥፍ ጭማሪ (ምስል 2 መ)።αS በ coacervates ውስጥ ስካፎልድ ፕሮቲን መሆኑን ለማሳየት፣ ΔNt-ታው ተብሎ የሚጠራውን የኤን-ተርሚናል ክልል (ቅሪ 1-150፣ ምስል 2e ይመልከቱ) የኤልኤልፒኤስ-የተረበሸ Tau mutant ባህሪን ለመመርመር ወስነናል።WF ማይክሮስኮፒ እና ኔፊሎሜትሪ አረጋግጠዋል ΔNt-ታው ራሱ LLPS (ምስል 2f እና ተጨማሪ ምስል 2d) እንዳላደረገው, ቀደም ሲል እንደዘገበው 14. ነገር ግን, αS በዚህ የተቆራረጡ የታው ልዩነት መፍትሄዎች ውስጥ ሲጨመሩ, የኤልኤልፒኤስ ሂደቱ ሙሉ በሙሉ ነበር. በተመሳሳዩ ሁኔታዎች እና የፕሮቲን ውህዶች ውስጥ ከሚገኙት ሙሉ መጠን ያላቸው የታው እና αS መፍትሄዎች ጠብታ ጥግግት ጋር በተጠጋ ጠብታ ጥግግት ወደነበረበት ተመልሷል።ይህ ሂደት በዝቅተኛ የማክሮ ሞለኪውላር መጨናነቅ (ተጨማሪ ምስል 2 ሐ) ሁኔታዎች ውስጥ ሊታይ ይችላል.በኤልኤልፒኤስ ሂደት ውስጥ የC-terminal αS ክልል ሚና ፣ ግን አጠቃላይ ርዝመቱ አይደለም ፣ በ LLPS ሂደት የ C-terminal truncated αS ተለዋጭ የሌሉት ቀሪዎች 104-140 (ምስል 1 ሀ) በመጠቀም ነጠብጣብ መፈጠርን በመከልከል ታይቷል (ΔCt- αS) ፕሮቲን (ምስል 2f እና ተጨማሪ ምስል 2 መ).የ αS እና ΔNt-ታው ኮሎካልላይዜሽን በ confocal fluorescence ማይክሮስኮፒ (ተጨማሪ ምስል 1 ለ) ተረጋግጧል።
በTau441 እና αS መካከል ያለውን የኤልኤልፒኤስ ዘዴ የበለጠ ለመፈተሽ፣ ተጨማሪ የታው ልዩነት ጥቅም ላይ ውሏል፣ ይኸውም ጥንድ ሄሊካል ክር ኮር (PHF) በማይክሮ ቱቡል ማሰሪያ ጎራ (MTBD) ውስጥ ያለው ክፍልፋይ፣ እሱም አራት ባህሪይ ተደጋጋሚ ጎራዎችን ከያዘ፣ በተለምዶ ደግሞ ይታወቃል። እንደ K18 ቁርጥራጭ (ምስል 2e ይመልከቱ).αS በፕሮላይን የበለጸገ ጎራ ውስጥ ከሚገኝ ማይክሮቱቡል ማሰሪያው ጎራ በፊት ባለው ቅደም ተከተል ወደ ታው ፕሮቲን እንደሚገናኝ በቅርቡ ተዘግቧል።ሆኖም፣ የPHF ክልል በአዎንታዊ ቻርጅ የተደረገ ቅሪቶች (ስእል 2e ይመልከቱ) በተለይም lysine (15% ቅሪት) የበለፀገ ነው፣ ይህም ክልል ለ αS/Tau ኮምፕሌክስ መጨናነቅ አስተዋጽኦ እንዳለው እንድንመረምር አነሳሳን።K18 ብቻ በተፈተኑት ሁኔታዎች (LLPS ቋት ከ15% PEG ወይም 20% dextran ጋር) LLPSን እስከ 100 μM ሊያስነሳ እንደማይችል አስተውለናል (ምስል 2f)።ነገር ግን፣ 50 µM αS ወደ 50µM K18 ስንጨምር K18 እና αS የያዙ የፕሮቲን ጠብታዎች በፍጥነት መፈጠር በኔፊሎሜትሪ (ተጨማሪ ምስል 2d) እና WF ማይክሮስኮፒ (ምስል 2f) ታይቷል።እንደተጠበቀው፣ ΔCt-αS የ K18 (ምስል 2f) የኤልኤልፒኤስ ባህሪን ወደነበረበት መመለስ አልቻለም።ኤልኤልፒኤስን ከ αS/ΔNt-ታው ወይም αS/Tau441 ጋር ሲነፃፀር የ αS/K18 ውህደት በትንሹ ከፍ ያለ የፕሮቲን መጠን እንደሚፈልግ እናስተውላለን፣ ሌሎች ነገሮች እኩል ናቸው።ይህ ቀደም ሲል 31 እንደተገለፀው የ αS C-terminal ክልል ከፕሮላይን-ሀብታም ታው ጎራ ጋር ከማይክሮቱቡል-ቢንዲንግ ጎራ ጋር ካለው ጠንካራ ግንኙነት ጋር የሚስማማ ነው።
ΔNt-ታው ኤልኤልፒኤስን αS በሌለበት ማድረግ እንደማይችል ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ በኤልኤልፒኤስ ሲስተሞች ውስጥ ባለ ሙሉ ርዝመት Tau (isotype፣ Tau441/Tau441) ስላለው ቀላልነት αS/ታው LLPSን ለመለየት እንደ ሞዴል መርጠናል።ውስብስብ (ሄትሮታይፕቲክ, αS/Tau441) የመደመር ሂደቶች.በ αS/ታው እና αS/ΔNt-Tau ስርዓቶች ውስጥ የ αS ድምርን ደረጃ (እንደ የተጨመቀ የፋዝ ፕሮቲን አካል ፣fαS ፣c) በማነፃፀር እና በተበታተነ የ SDS-PAGE ትንተና (2e ይመልከቱ) ፣ በጣም ተመሳሳይ እሴቶች ተገኝተዋል ለሁሉም ፕሮቲኖች በተመሳሳይ ትኩረት።በተለይም fαS,c 84 ± 2% እና 79 ± 7% ለ αS/Tau እና αS/ΔNt-ታው አግኝተናል, ይህም በ αS እና tau መካከል ያለው የሄትሮታይክ ግንኙነት በ tau ሞለኪውሎች መካከል ካለው ግንኙነት የላቀ መሆኑን ይጠቁማል.መካከል።
ከተለያዩ ፖሊኬክተሮች ጋር ያለው መስተጋብር እና በ αS ኪኔቲክስ ላይ ያለው የኮንደንስሽን ሂደት ተጽእኖ በመጀመሪያ በፎተሪንግ (FRAP) ዘዴ ከተሰራ በኋላ በፍሎረሰንት ማገገሚያ ጥናት ነበር.αS/Tau441፣ αS/ΔNt-Tau እና αS/pLK coacervates (100 μM αS በ2 μM αS AF488-αS እና 100 μM Tau441 ወይም ΔNt-Tau ወይም 1 mM pLK) ሞከርን።የናሙና ክፍሎችን ከተቀላቀለ በኋላ በመጀመሪያዎቹ 30 ደቂቃዎች ውስጥ መረጃ ተገኝቷል.ከተወካይ የ FRAP ምስሎች (ምስል 3a, αS / Tau441 condensation) እና ተጓዳኝ የጊዜ ኮርስ ኩርባዎች (ምስል 3 ለ, ተጨማሪ ምስል 3), የ αS kinetics ከ Tau441 coacervates ጋር በጣም ተመሳሳይ መሆኑን ማየት ይቻላል.እና ΔNt-Tau, ይህም በ pLK በጣም ፈጣን ነው.በ FRAP መሠረት (በካንግ እና ሌሎች 35 እንደተገለፀው) ለ αS በ coacervate ውስጥ ያለው የስርጭት መጠን D = 0.013 ± 0.009 µm2/s እና D = 0.026 ± 0.008 µm2/s ለ αS/Tau441 እና αS / ስርዓት.pLK፣ Tau እና D = 0.18 ± 0.04 µm2/s፣ በቅደም ተከተል (ምስል 3c)።ነገር ግን በተበታተነው ደረጃ ውስጥ ያለው የስርጭት መጠን αS ከሁሉም የተጨመቁ ደረጃዎች የሚበልጥ በርካታ ትዕዛዞች አሉት። ( D = 8 ± 4 µm2/s)።ስለዚህ የ αS ትርጉም ኪኔቲክስ በተበታተነው ምዕራፍ ውስጥ ካሉት ፕሮቲኖች ጋር ሲነፃፀር በ coacervates ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል በሞለኪውላዊ መጨናነቅ ውጤቶች ፣ ምንም እንኳን ሁሉም coacervates ከተፈጠሩ በኋላ ባለው የመጀመሪያ ግማሽ ሰዓት ውስጥ ፈሳሽ የሚመስሉ ንብረቶችን ቢይዙም ፣ ከ tau ደረጃ በተቃራኒ።ፈጣን ኪኔቲክስ በ pLK condensate ውስጥ።
a–c FRAP የ αS ተለዋዋጭ (2% AF488 የተሰየመ αS) በኤሌክትሮስታቲክ ኮአሰርሬትስ ውስጥ።የ αS/Tau441 FRAP ትንታኔዎች በሶስት እጥፍ የሚወከሉ ምስሎች በ (ሀ) ውስጥ ይታያሉ፣ ቀይ ክበቦች ቀለም የተቀነሱ ቦታዎችን ያመለክታሉ።የመለኪያ አሞሌ 5µm ነው።ለ 100 μM αS እና የTau441 (ቀይ) ወይም ΔNt-ታው (ሰማያዊ) ወይም pLK (አረንጓዴ) ውህዶችን በመጠቀም አማካኝ የFRAP ኩርባዎች እና (ሐ) የተሰሉ የስርጭት ቅንጅቶች (D) ለ5-6 (N) የተለያዩ ጠብታዎች ከሶስት ሙከራዎች በአሥር እጥፍ የ LLPS ትኩረት.የ FRAP ከርቭ መደበኛ መዛባት በጥላ ቀለም ይታያል።ለማነፃፀር፣ በተበታተነው ደረጃ ውስጥ ያለው የስርጭት መጠን αS በሶስት እጥፍ በፍሎረሰንት ኮርሬሽን ስፔክትሮስኮፒ (FCS) በመጠቀም ተወስኗል (ተጨማሪ ምስል 3ን ይመልከቱ እና ለበለጠ መረጃ)።መ ያለማቋረጥ የ X-band EPR spectra 100 μM TEMPOL-122-αS በኤልኤልፒኤስ ቋት ውስጥ ያለ ምንም ፖሊኬሽን (ጥቁር) ወይም 100 μM Tau441 (ቀይ) ወይም ΔNt-Tau (ሰማያዊ) ወይም 1 mM pLK (አረንጓዴ) ፊት።ውስጠቱ በጣም አስገራሚ ለውጦች የሚከሰቱበት የጠንካራ የመስክ መስመሮችን አጉልቶ ያሳያል.e የ 50 μM TEMPOL-122-αS ማሰሪያ ኩርባዎች LLPS በማይኖርበት ጊዜ ከተለያዩ ፖሊኬተሮች ጋር (PEG የለም)።ከመደበኛው የ EPR ስፔክትረም ባንድ II (IIII/III) ጋር ሲነፃፀር የተቀነሰው የባንድ III ስፋት የ Tau441 (ቀይ) ፣ ΔNt-ታው (ሰማያዊ) እና pLK (አረንጓዴ) የሞላር ሬሾን ይጨምራል።ባለቀለም መስመሮች በእያንዳንዱ ጥምዝ ላይ n ተመሳሳይ እና ገለልተኛ ማያያዣ ጣቢያዎች ያለው ሻካራ ማሰሪያ ሞዴል በመጠቀም ለመረጃ ተስማሚነትን ያሳያሉ።ጥሬ መረጃ የሚቀርበው በጥሬ መረጃ ፋይሎች መልክ ነው።
እንደ ማሟያ፣ የተመራ ስፒን መለያ (ኤስዲኤስኤል) እና ቀጣይነት ያለው ኤሌክትሮን ፓራማግኔቲክ ሬዞናንስ (CW-EPR) በመጠቀም የ αSን ተለዋዋጭነት በተለያዩ coacervates መርምረናል።ይህ ዘዴ የተፈናቃዮቹን ተለዋዋጭነት እና ተለዋዋጭነት በተጨባጭ ቀሪ መፍትሄ36,37,38 ሪፖርት ለማድረግ በጣም ጠቃሚ ሆኖ ተገኝቷል.ለዚህም፣ የሳይስቴይን ቀሪዎችን በነጠላ ሳይስ ሚውቴሽን ገንብተናል እና 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) spin probeን ተጠቀምን።የMaleimide ተዋጽኦዎች ስያሜ ይሰጧቸዋል።በተለይም የTEMPOL መመርመሪያዎችን በ122 ወይም 24 αS (TEMPOL-122-αS እና TEMPOL-24-αS) ላይ አስገብተናል።በመጀመሪያው ጉዳይ ላይ ከፖሊኬሽን ጋር በመተባበር የፕሮቲን C-terminal ክልል ላይ እናተኩራለን.በምትኩ፣ ቦታ 24 በኮንደንስቱ ውስጥ ስላሉት ፕሮቲኖች አጠቃላይ እንቅስቃሴ መረጃ ሊሰጠን ይችላል።በሁለቱም ሁኔታዎች ለተበታተነው ደረጃ ፕሮቲኖች የተገኙት የ EPR ምልክቶች በፍጥነት በሚንቀሳቀስ ሁኔታ ውስጥ ከሚገኙት ናይትሮክሳይድ ራዲካልስ ጋር ይዛመዳሉ።በ tau ወይም pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ወይም ΔNt-Tau በ 1:1 ወይም pLK በ 1:10 ጥምርታ) ፊት ለፊት ከተከፋፈሉ በኋላ, አንጻራዊ ከፍተኛ ጥንካሬ መጨመር በ ውስጥ ታይቷል. የ αS የ EPR ስፔክትረም.የኪሳራ መስመሩ እየሰፋ ሄዷል፣ ይህም በ droplets ውስጥ ያለው የ αS reorientation kinetics የተቀነሰ ከፕሮቲን ጋር ሲነጻጸር በዲሉቱ ምዕራፍ (ምስል 3d፣ ተጨማሪ ምስል 4 ሀ) ያሳያል።እነዚህ ለውጦች በቦታ 122 ላይ ጎልተው ይታያሉ።በ24ኛው ቦታ ላይ pLK መገኘት የፍተሻውን እንቅስቃሴ ላይ ተጽእኖ አላሳደረም፣በቦታ 122 የስፔክትራል መስመር ቅርፅ በከፍተኛ ሁኔታ ተቀይሯል (ተጨማሪ ምስል 4 ሀ)።ስፒን የተሰየመውን IDP38,39 ተለዋዋጭ ሁኔታን ለመግለፅ በተለምዶ የሚጠቀመውን አይሶትሮፒክ ሞዴል (ተጨማሪ ምስል 5 ሀ) በመጠቀም በሁለት αS/ፖሊኬሽን ሲስተሞች 122 ላይ ያለውን ስፔክትራን ለመቅረጽ ስንሞክር የሙከራውን ስፔክትራ እንደገና መገንባት አልቻልንም።.የ 24 ሽክርክሪቶች አቀማመጥ ስፔክታል ማስመሰል ንፅፅር (ተጨማሪ ምስል 5 ሀ)።ይህ የሚያመለክተው በ polycations ፊት የ C-terminal ክልል αS ስፒን ውቅሮች ቦታ ላይ ተመራጭ ቦታዎች እንዳሉ ነው።በሙከራ EPR ሁኔታዎች (84 ± 2%, 79 ± 7%, እና 47 ± 4% ለ αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau እና αS/pLK, በቅደም ተከተል-ተጨማሪ ይመልከቱ-ተጨማሪ ይመልከቱ). ምስል 2e የመረጃ ትንተና ሐ) ፣ በ EPR ዘዴ የተገኘው ማስፋፋት በዋናነት የ C-terminal ክልል αS ከተለያዩ ፖሊኬተሮች ጋር በ condensed phase ውስጥ ያለውን መስተጋብር እንደሚያንፀባርቅ ማየት ይቻላል (TEMPOL-122- ሲጠቀሙ ዋናው ለውጥ) αS), እና የፕሮቲን ኮንዲሽን አይደለም.በምርመራው ውስጥ የማይክሮቪስኮሲስ መጨመር ይታያል.እንደተጠበቀው፣ 1M NaCl ወደ ድብልቁ ሲጨመር ከኤልኤልፒኤስ በስተቀር የፕሮቲን EPR ስፔክትረም ሙሉ በሙሉ ተመልሷል (ተጨማሪ ምስል 4 ለ)።በአጠቃላይ መረጃዎቻችን እንደሚጠቁሙት በCW-EPR የተገኙት ለውጦች በዋናነት የC-terminal ክልል αSን ከተለያዩ ፖሊኬተሮች ጋር በ condensed phase ውስጥ ያለውን መስተጋብር የሚያንፀባርቁ ሲሆን ይህ መስተጋብር ከ ታው ይልቅ በpLK የበለጠ ጠንካራ ይመስላል።
በ coacervate ውስጥ ስላሉት ፕሮቲኖች የበለጠ መዋቅራዊ መረጃ ለማግኘት NMRን በመፍትሔው በመጠቀም የኤልኤልፒኤስን ስርዓት ለማጥናት ወስነናል።ነገር ግን፣ በተበታተነው ምዕራፍ ውስጥ የቀረውን የ αS ክፍልፋይ ብቻ ነው ልንገነዘበው የምንችለው፣ ይህም በ coacervate ውስጥ ያለው የፕሮቲን ተለዋዋጭነት በመቀነሱ እና በመፍትሔው ስር ባለው የ NMR ትንተና ጥቅጥቅ ባለ ደረጃ ሊሆን ይችላል።NMR (ተጨማሪ ምስል 5 ሐ, መ) በመጠቀም በተበታተነው የኤልኤልፒኤስ ናሙና ውስጥ የቀረውን ፕሮቲን አወቃቀር እና ተለዋዋጭነት ስንመረምር ፕሮቲን በ pLK እና ΔNt-ታው ፊት ተመሳሳይ ባህሪ እንደነበረ አስተውለናል ፣ ሁለቱም በሁለተኛ ደረጃ መዋቅር እና የፕሮቲን የጀርባ አጥንት ተለዋዋጭነት ውስጥ ያሉት, በሁለተኛ ደረጃ ኬሚካላዊ ለውጥ እና R1ρ መዝናናት ላይ በተደረጉ ሙከራዎች ተገለጡ.የNMR መረጃ እንደሚያሳየው የ αS C-terminus ከ polycations ጋር ባለው መስተጋብር የተነሳ የተዘበራረቀ ተፈጥሮውን እንደሌሎች ፕሮቲን ቅደም ተከተሎች በመያዝ የተመጣጠነ ተለዋዋጭነት ከፍተኛ ኪሳራ እንደሚደርስበት ያሳያል።
በTEMPOL-122-αS የተጨመቀ ደረጃ ላይ የሚታየው የCW-EPR ሲግናል ማስፋፋት የፕሮቲን ከፖሊኬሽን ጋር ያለውን መስተጋብር የሚያንፀባርቅ በመሆኑ፣ ኤልኤልፒኤስ በማይኖርበት ጊዜ αS ከተለያዩ ፖሊኬተሮች ጋር ያለውን ትስስር ለመገምገም የEPR titration አደረግን (ምንም ክምችት የለም)። ቋት ኤልኤልፒኤስ)፣ ግንኙነቶቹ በድብልቅ እና በተከማቸ ደረጃዎች አንድ አይነት መሆናቸውን ይጠቁማል (ይህም በእኛ መረጃ የተረጋገጠው ተጨማሪ ምስል 4 ሀ እና ተጨማሪ ምስል 6)።ግቡ ሁሉም የጋራ ፈሳሽ መሰል ባህሪያቶቻቸው ቢኖሩም፣ በሞለኪውላዊ ደረጃ ማንኛውንም መሰረታዊ ልዩነት ባህሪ እንደሚያሳዩ ለማየት ነበር።እንደተጠበቀው፣ የ EPR ስፔክትረም የ polycation ትኩረትን በመጨመር ሰፋ፣ የሁሉም መስተጋብር አጋሮች በሞለኪውላዊ መስተጋብር ምክንያት የሞለኪውላዊ ተለዋዋጭነት መቀነስን በማንፀባረቅ ወደ ሙሌት (ምስል 3e ፣ ተጨማሪ ምስል 6)።pLK ይህንን ሙሌት ከ ΔNt-ታው እና ታው441 ጋር ሲነጻጸር በትንሹ የሞላር ሬሾ (ፖሊኬሽን፡αS) አሳክቷል።በእውነቱ፣ መረጃውን ከተጠጋጋ ማሰሪያ ሞዴል ጋር በማነፃፀር ተመሳሳይ እና ገለልተኛ ማያያዣ ጣቢያዎችን ግምት ውስጥ በማስገባት የ pLK (~ 5 μM) የመለያየት ቋሚነት ከTau441 ወይም ΔNt-Tau (~ 50 μM በታች የሆነ ቅደም ተከተል) ያሳያል። ).µM)ምንም እንኳን ይህ ግምታዊ ግምት ቢሆንም፣ ይህ የሚያመለክተው αS ለተከታታይ አወንታዊ ክፍያ ክልሎች ላላቸው ቀላል ፖሊኬክተሮች ከፍ ያለ ቅርርብ አለው።ይህንን በ αS እና በተለያዩ ፖሊኬሽን መካከል ያለውን ዝምድና ልዩነት ከግምት ውስጥ በማስገባት የፈሳሽ ባህሪያቸው በጊዜ ሂደት ሊለዋወጥ ስለሚችል በተለያዩ የ LSPT ሂደቶች ሊሰቃዩ እንደሚችሉ ገምተናል።
በፕሮቲን coacervate ውስጥ በጣም የተጨናነቀ አካባቢን እና የፕሮቲን አሚሎይድ ተፈጥሮን ከግምት ውስጥ በማስገባት የ LSPT ሂደቶችን ለመለየት የ coacervate ባህሪን በጊዜ ሂደት ተመልክተናል።BF እና CF microscopy (ስእል 4) በመጠቀም፣ αS/Tau441 በከፍተኛ መጠን በመፍትሔው ውስጥ እንደሚተባበር ተመልክተናል፣ ይህም እንደተጠበቀው ከጉድጓዱ ግርጌ ያለውን ወለል ላይ የሚገናኙ እና የሚያጥቡት ትላልቅ ጠብታዎች ይፈጥራሉ (ተጨማሪ ምስል) 7 ዲ);እነዚህን ከታች የተሰሩ አወቃቀሮችን "የፕሮቲን ራፎች" ብለን እንጠራቸዋለን.እነዚህ አወቃቀሮች የመዋሃድ ችሎታቸውን እንደያዙ (ተጨማሪ ምስል 7 ለ) እና LLPS ከተቀሰቀሰ በኋላ ለብዙ ሰዓታት ሊታዩ ስለሚችሉ ፈሳሽ ሆነው ቆይተዋል (ምስል 4 እና ተጨማሪ ምስል 7 ሐ)።ለኤሌክትሮስታቲክ coacervates ያልተመጣጠነ ክፍያዎች እና በዚህም ከፍተኛ electrostatic ወለል እምቅ ጋር እንደተጠበቀው, የእርጥበት ሂደት hydrophilic ይልቅ hydrophobic ቁሶች (ተጨማሪ ምስል. 7 ሀ) ላይ ሞገስ መሆኑን ተመልክተናል.በተለይም፣ αS/ΔNt-ታው ጥምረት እና rafting በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል፣ αS/pLK ኮንደንስ በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል (ምስል 4)።በአጭር ጊዜ ውስጥ, የ αS / pLK ጠብታዎች የሃይድሮፊሊካዊ ገጽን ማጣመር እና እርጥብ ማድረግ ችለዋል, ነገር ግን ይህ ሂደት በፍጥነት ቆመ እና ከ 5 ሰአታት ቆይታ በኋላ, የተገደበ የውህደት ክስተቶች ብቻ እና ምንም እርጥብ አልታየም.- ጄል-ነጠብጣብ ሽግግር.
ተወካይ BF (ግራጫ ፓነሎች) እና CF (የቀኝ ፓነሎች፣ AF488 ምልክት የተደረገባቸው αS በአረንጓዴ) 100 µM αS (1% የፍሎረሰንት መለያ) የያዙ የኮአሰርቫት ናሙናዎች በኤልኤልፒኤስ ቋት ውስጥ 100 µM Tau441 (የላይ) ማይክሮፒክስ ምስሎች ባሉበት -ታው (መሃል) ወይም 1 mM pLK (ከታች) በተለያየ የመታቀፊያ ጊዜ እና የትኩረት ቁመቶች (z, ከጣፋዩ ጉድጓድ ግርጌ ርቀት).ሙከራዎቹ በተመሳሳዩ ውጤቶች 4-6 ጊዜ ተደግመዋል.αS/Tau441 coacervates ከ24 ሰአታት በኋላ እርጥብ ስለሚደረግ ከምስሉ የሚበልጡ ራፎች ይመሰርታሉ።የሁሉም ምስሎች ልኬት አሞሌ 20µm ነው።
ከዚያም በαS/Tau441 LLPS ውስጥ የተፈጠሩት ትላልቅ ፈሳሽ የሚመስሉ የፕሮቲን ገንዳዎች ወደ የትኛውም ፕሮቲኖች አሚሎይድ ውህደት ያመራሉ ወይ ብለን ጠየቅን።ከላይ በተገለጹት ተመሳሳይ ሁኔታዎች የ αS/Tau441 ጠብታዎችን ብስለትን ተከትለናል ነገር ግን 1 μM AF488-Labeled αS እና Atto647N-Labeled Tau441 (ምስል 5a) በመጠቀም።እንደተጠበቀው, በማብሰያ ሂደቱ ውስጥ ሙሉ የፕሮቲን አከባቢን አስተውለናል.የሚገርመው ከካ.ከ 5 ሰአታት በኋላ, ይበልጥ ኃይለኛ ያልሆኑ ክብ ቅርጽ ያላቸው መዋቅሮች በሬሳዎቹ ውስጥ ተስተውለዋል, እኛ "ነጥቦች" ብለን እንጠራዋለን, አንዳንዶቹ በ αS ኮሎካል የተደረጉ እና አንዳንዶቹ በ Tau441 (ምስል 5a, ነጭ ቀስቶች) የበለፀጉ ናቸው.እነዚህ ቦታዎች ሁልጊዜ ከ αS/ΔNt-ታው ይልቅ ለ αS/ΔNt-ታው በከፍተኛ መጠን በራፍቶች ውስጥ ተስተውለዋል።በ pLK እና Tau ስርዓቶች ጠብታዎች ውስጥ ለመዋሃድ/እርጥብ ብቁ ያልሆኑ ልዩ ነጠብጣቦች አልነበሩም።እነዚህ αS እና Tau441 የሚያካትቱት እድፍ አሚሎይድ የሚመስሉ ስብስቦች መሆናቸውን ለመፈተሽ በሲኤፍ ማይክሮስኮፒ በመጠቀም ታው441 በ Atto647N እና 12.5 μM amyloid-specific thioflavin-T (ThT) ከጅምሩ የተጨመረበት ሙከራ አድርገናል።ማቅለሚያ.ምንም እንኳን ThT-staining αS/Tau441 ጠብታዎች ወይም ራፍቶች ከ24 ሰአታት በኋላ እንኳን ባይታዩም (ምስል 5b፣ በላይኛው ረድፍ - በፕሮቲን ራፍት ላይ የሚቀሩ ጠብታዎች)፣ Atto647N-Tau441 የያዙ ThT አወንታዊ አወቃቀሮች በራፍቶች ውስጥ በጣም ደካማ ነበሩ።ይህ ቀደም ሲል የተገለጹትን የቦታዎች መጠን፣ ቅርፅ እና ቦታ ይደግማል (ምስል 5 ለ ፣ መካከለኛ እና የታችኛው ረድፎች) ይህ ቦታዎቹ በእርጅና ፈሳሽ ውስጥ ከተፈጠሩ አሚሎይድ መሰል ስብስቦች ጋር ሊዛመዱ እንደሚችሉ ይጠቁማል።
WF 25 μM αS በተለያዩ የመታቀፊያ ጊዜዎች እና የትኩረት ከፍታዎች (z፣ ከማይታሰረው የታችኛው ርቀት) በ 25 μM Tau441 (1 μM AF488 የተሰየመ αS እና Atto647N-የተሰየመው ታው441) በማይክሮስኮፕ ሳህን ከኤልኤልፒኤስ ቋት ጋር) ፊት ለፊት። .በተመሳሳይ ውጤት ስድስት ሙከራዎች በተናጥል ተደግመዋል።b CF በአጉሊ መነጽር የ 25 μM αS ምስል 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-የተሰየመ Tau441) እና 12.5 μM thioflavin-T (ThT) ፊት.ክብደት ያላቸው የፕሮቲን ጠብታዎች እና የተከማቸ የፕሮቲን ራፎች እና ነጠብጣቦች ከላይ እና መካከለኛ ረድፎች ላይ በቅደም ተከተል ይታያሉ።የታችኛው ረድፍ የራፎች ምስሎችን ያሳያል እና ከ 3 ገለልተኛ ቅጂዎች የሚወርዱ።ነጭ ቀስቶች በሁለቱም ፓነሎች ውስጥ ThT-positive ነጥቦችን ያመለክታሉ።የሁሉም ምስሎች ልኬት አሞሌ 20µm ነው።
ከፈሳሽ ወደ ድፍን በሚሸጋገርበት ጊዜ በ coacervate ፕሮቲን አውታር ላይ ያለውን ለውጥ በበለጠ ዝርዝር ለመመርመር የፍሎረሰንስ የህይወት ዘመን ምስል (FLIM) እና Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (ምስል 6 እና ተጨማሪ ምስል 8 እና 9) ተጠቀምን።የንብርብሩን ኮአሰርቬት ብስለት ወደ ተጨምቆ ወይም ወደ ጠንካራ መሰል የተዋሃደ ፕሮቲን መዋቅር መፈጠሩ በፕሮቲን እና በፍሎረሰንት መፈተሻ መካከል መቀራረብ እንዲፈጠር እንደሚያደርግ፣ ይህም በአጭር የመመርመሪያ የህይወት ዘመን (τ) ውስጥ የሚታየውን የማጥፋት ውጤት እንደሚያመጣ ገምተናል። ቀደም ሲል እንደተገለፀው 40.,41,42.በተጨማሪም፣ ለድርብ ምልክት የተደረገባቸው ናሙናዎች (AF488 እና Atto647N እንደ FRET ለጋሽ እና ተቀባይ ማቅለሚያዎች፣ በቅደም ተከተል) ይህ የ τ ቅነሳ ከኮአሰርቬት ኮንደንስሽን እና በ LSPT ጊዜ የ FRET(E) ቅልጥፍናን በመጨመር አብሮ ሊሄድ ይችላል።በLLPS αS/Tau441 እና αS/ΔNt-ታው ናሙናዎች (25 μM እያንዳንዱ ፕሮቲን በLLPS ቋት ውስጥ 1 µM AF488 αS እና/ወይም Atto647N የሚል መለያ በ Tau441 ወይም ΔNt-Tau) ውስጥ በጊዜ ሂደት የራፍት እና የቦታ አፈጣጠርን ተከታትለናል።የ AF488 (τ488) እና Atto647N (τ647N) መመርመሪያዎች የፍሎረሰንት የህይወት ዘመን coacervates ሲበስል (ምስል 6 እና ተጨማሪ ምስል 8 ሐ) በመጠኑ እንደሚቀንስ አጠቃላይ አዝማሚያ አስተውለናል።የሚገርመው፣ ይህ ለውጥ በራፍቶች ውስጥ ላሉ ነጥቦች በከፍተኛ ሁኔታ ተሻሽሏል (ምስል 6 ሐ)፣ ይህም ተጨማሪ የፕሮቲን ጤዛ በነጥቦች ላይ መከሰቱን ያሳያል።ይህንን ለመደገፍ ለ 24 ሰአታት እድሜ ላላቸው የ αS/ΔNt-ታው ጠብታዎች (ተጨማሪ ምስል 8d) በፍሎረሰንት የህይወት ዘመን ላይ ምንም አይነት ጉልህ ለውጥ አልታየም (ተጨማሪ ምስል 8d) ይህም ጠብታ ጄልላይዜሽን ከቦታ ቦታ የተለየ ሂደት እንደሆነ እና ይህም ከከፍተኛ ሞለኪውላር መልሶ ማደራጀት ጋር አብሮ የማይሄድ መሆኑን ይጠቁማል። coacervates ውስጥ.ነጥቦቹ በ αS ውስጥ የተለያየ መጠን እና ተለዋዋጭ ይዘት እንዳላቸው ልብ ሊባል የሚገባው ነው, በተለይም ለ αS / Tau441 ስርዓት (ተጨማሪ ምስል 8e).የSpot fluorescence የህይወት ዘመን መቀነስ ከኃይለኛነት መጨመር ጋር ተያይዞ በተለይም Atto647N Tau441 (ተጨማሪ ምስል 8a) እና ለሁለቱም αS/Tau441 እና αS/ΔNt-Tau ስርዓቶች ከፍተኛ የ FRET ቅልጥፍናዎች በኤልኤልፒኤስ አምስት ሰዓታት ውስጥ ተጨማሪ መጨናነቅን ያሳያል። ከተቀሰቀሰ በኋላ በስታቲስቲክ ኤሌክትሪክ ውስጥ ያሉት ፕሮቲኖች ተሰባሰቡ።ከ αS/ΔNt-ታው ጋር ሲነጻጸር ዝቅተኛ τ647N እና በመጠኑ ከፍ ያለ τ488 እሴቶችን በαS/Tau441 ቦታዎች ላይ ተመልክተናል፣ ከዝቅተኛ እና የበለጠ ተመሳሳይነት ከሌላቸው የFRET እሴቶች ጋር።ምናልባት፣ ይህ በ αS/Tau441 ስርዓት፣ የታየው እና የሚጠበቀው የ αS ብዛት በድምር ብዙ ጊዜ ከታው ጋር ሲወዳደር ብዙ ጊዜ ንኡስ ስቶይዮሜትሪክ ነው ከሚለው እውነታ ጋር የተያያዘ ሊሆን ይችላል ምክንያቱም Tau441 እራሱ LLPS እና ድምርን ሊያስተናግድ ስለሚችል (ተጨማሪ ምስል 8e) .ሆኖም፣ የጠብታ ጥምርነት ደረጃ፣ የራፍት አፈጣጠር እና፣ በአስፈላጊ ሁኔታ፣ ፈሳሽ በሚመስሉ ኮአሰርቫቶች ውስጥ ያለው የፕሮቲን ውህደት ከፍተኛው ሁለቱም Tau441 እና αS ሲገኙ ነው።
የዕድሜ ልክ የፍሎረሰንት ማይክሮስኮፒ (FLIM) ምስሎች αS/Tau441 እና αS/ΔNt-ታው በ25 μM ከእያንዳንዱ ፕሮቲን (1 μM AF488 የተሰየመ αS እና 1 μM Atto647N-Labeled Tau441 ወይም ΔNt-Tau) በLLPS ውስጥዓምዶቹ የኤልኤልፒኤስ ናሙናዎችን ወካይ ምስሎች በተለያዩ የብስለት ጊዜዎች (30 ደቂቃ፣ 5 ሰዓት እና 24 ሰዓት) ያሳያሉ።ቀዩ ፍሬም αS/Tau441 ቦታዎችን የያዘውን ክልል ያሳያል።የህይወት ርዝማኔዎች እንደ ቀለም አሞሌዎች ይታያሉ.ለሁሉም ምስሎች ልኬት ባር = 20 µm።ለ የተመረጠው ቦታ በ FLIM አጉላ፣ በፓነል ሀ ውስጥ በቀይ ሳጥን ውስጥ የሚታየው።የህይወት ወሰኖች በፓነል ሀ ውስጥ ካለው ተመሳሳይ የቀለም ልኬት በመጠቀም ይታያሉ።የመጠን አሞሌ = 5µmሐ ሂስቶግራም AF488 (ከ αS ጋር ተያይዟል) ወይም Atto647N (ከታው ጋር የተያያዘ) ለተለያዩ የፕሮቲን ዓይነቶች (ነጠብጣቦች-ዲ-፣ ራፍት-አር- እና ስፔክል-ፒ) በ FLIM ምስሎች ለ αS- የተመዘገቡ) የጊዜ ስርጭት የTau441 የህይወት ዘመን እና αS/ΔNt-ታው coacervate ናሙናዎች (N = 17-32 ROI ለ D, 29-44 ROI ለ R, እና 21-51 ROI ለ ነጥቦች).አማካኝ እና መካከለኛ እሴቶች እንደ ቢጫ ካሬዎች እና ጥቁር መስመሮች በሳጥኖች ውስጥ በቅደም ተከተል ይታያሉ።የሳጥኑ የታችኛው እና የላይኛው ድንበሮች እንደ ቅደም ተከተላቸው የመጀመሪያውን እና ሶስተኛውን ኳርቲል ይወክላሉ እና በ 1.5-fold interquartile ክልል (IQR) ውስጥ ያለው ዝቅተኛ እና ከፍተኛ እሴቶች እንደ ጢስ ​​ማውጫዎች ይታያሉ።ውጫዊ ገጽታዎች እንደ ጥቁር አልማዞች ይታያሉ.በጥንድ ስርጭቶች መካከል ያለው ስታቲስቲካዊ ጠቀሜታ በሁለት-ናሙና ቲ-ሙከራ ተወስኗል፣ ይህም እኩል ያልሆኑ ልዩነቶችን በማሰብ ነው።ባለ ሁለት ጭራ ቲ-ሙከራ p-እሴቶች ለእያንዳንዱ ጥንድ ንፅፅር ውሂብ በኮከቦች ይታያሉ (* p-value> 0.01፣ ** p-value> 0.001፣ *** p-value> 0.0001፣ **** p-እሴት > 0.00001)፣ ns ቸልተኝነትን ያሳያል (p-እሴት > 0.05)።ትክክለኛው የፒ ዋጋዎች በማሟያ ሠንጠረዥ 1 ውስጥ ተሰጥተዋል, እና ዋናው መረጃ እንደ ጥሬ የውሂብ ፋይሎች ቀርቧል.
የአሚሎይድ መሰል የስፔክሎች/ድምር ተፈጥሮን የበለጠ ለማሳየት ለ 24 ሰአታት ያልቆሸሸ የኮአሰርቫት ናሙናዎችን በከፍተኛ የ(1M) NaCl እናክመዋለን፣ይህም ከፕሮቲን ኮአሰርቬትስ ውህዶች እንዲለዩ አድርጓል።የአቶሚክ ሃይል ማይክሮስኮፒ (ኤኤፍኤም) በመጠቀም የተገለሉ ስብስቦች (ማለትም የተበታተነ የስብስብ መፍትሄ) ሲታዩ፣ 15 nm ያህል የሆነ መደበኛ ቁመት ያለው በዋነኝነት ክብ ቅርጽ ያለው ሞርፎሎጂ ተመልክተናል፣ ይህም ከፍተኛ የጨው ክምችት ካለው ጋር ተመሳሳይ ነው። በ ላይ ላይ ባለው ኃይለኛ የሃይድሮፎቢክ ተጽእኖ ምክንያት የተለመደው አሚሎይድ ፋይብሪልስ ባህሪ (ፋይብሪሎች በተለምዶ ~ 10 nm ቁመት እንዳላቸው ልብ ይበሉ) (ተጨማሪ ምስል 10 ሀ).የሚገርመው ነገር፣ የነጠላ ድምር ስብስቦች በቲኤችቲ በመደበኛ የThT fluorescence ፍተሻ ሲታከሉ፣ የ ThT fluorescence quantum ምርት ከፍተኛ ጭማሪ አስተውለናል፣ ይህም ማቅለሚያው ከተለመደው αS amyloid fibrils (ተጨማሪ ምስል 10b) ጋር ሲቀላቀል ከታየው ጋር ሲነጻጸር፣ ያንን የሚጠቁም ነው። የ coacervate ስብስቦች አሚሎይድ የሚመስሉ አወቃቀሮችን ይይዛሉ..በእርግጥ፣ ጥቅሎቹ ለከፍተኛ የጨው ክምችት ታጋሽ ነበሩ ነገር ግን ለ 4M ጓኒዲን ክሎራይድ (GdnHCl)፣ ልክ እንደ ዓይነተኛ አሚሎይድ ፋይብሪሎች (ተጨማሪ ምስል 10 ሐ) ስሜታዊ ናቸው።
በመቀጠል፣ ነጠላ ሞለኪውል ፍሎረሰንስ፣ የተወሰነ የፍሎረሰንስ ቁርኝት/ክሮስ-ኮርሬሌሽን ስፔክትሮስኮፒ (FCS/FCCS)፣ እና ባለ ሁለት ቀለም የአጋጣሚ ነገር ማወቂያ (TCCD) የፍንዳታ ትንተና በመጠቀም የስብስብ ስብጥርን ተንትነናል።ለዚህም፣ ከ24 ሰአታት ቆይታ በኋላ የተፈጠሩትን ውህዶች በ100 μl LLPS ናሙናዎች αS እና Tau441 (ሁለቱም 25 μM) ከ1 μM AF488 የተሰየመ αS እና 1 μM Atto647N-Labeled Tau441 ጋር ለይተናል።በኤልኤልፒኤስ እና በፕሮቲን መካከል ሊኖር የሚችለውን የኤሌክትሮስታቲክ መስተጋብር ለመከላከል በተመሳሳዩ PEG-ነጻ ቋት እና 1M NaCl (ተመሳሳዩን ቋት ከኮአሰርቫት ለመለየት ጥቅም ላይ የሚውል) በመጠቀም የተገኘውን የተበታተነ አጠቃላይ መፍትሄ ወደ ሞኖሞሊኩላር ሁኔታ ይቀንሱ።የአንድ ነጠላ ሞለኪውል የጊዜ አቅጣጫ ምሳሌ በስእል 7 ሀ ውስጥ ይታያል.የFCCS/FCS ትንተና (የመስቀለኛ ግንኙነት፣ CC እና autocorrelation፣ AC) እንደሚያሳየው αS እና ታው የያዙ ውህደቶች በናሙናዎቹ ውስጥ በብዛት እንደነበሩ (በስእል 7b፣ በግራ ፓነል ላይ ያለውን የCC ከርቭ ይመልከቱ) እና ከመጠን ያለፈ ሞኖሜሪክ ፕሮቲን እንደ የማሟሟት ሂደት ውጤት (የ AC ኩርባዎችን በስእል 7b, በግራ ፓነል ይመልከቱ).ሞኖሜሪክ ፕሮቲኖችን ብቻ የያዙ ናሙናዎችን በመጠቀም በተመሳሳዩ የመፍትሄ ሁኔታዎች ውስጥ የተደረጉ የቁጥጥር ሙከራዎች ምንም የሲሲ ኩርባዎች አላሳዩም ፣ እና የ AC ኩርባዎቹ ከአንድ-ክፍል ስርጭት ሞዴል (ኢክ. 4) ጋር በጥሩ ሁኔታ ይጣጣማሉ ፣ ሞኖሜሪክ ፕሮቲኖች የሚጠበቀው የስርጭት ቅንጅቶች አሏቸው (ምስል 7b) ), የቀኝ ፓነል).የተዋሃዱ ቅንጣቶች ስርጭት ከ1 μm2/s ያነሰ ነው፣ እና የሞኖሜሪክ ፕሮቲኖች 1 µm2/s ያህል ነው።50-100 µm/s;እሴቶች ከዚህ ቀደም ከታተሙ እሴቶች ጋር ተመሳሳይ ናቸው ለ sonicated αS amyloid fibrils እና monomeric αS በተመሳሳዩ የመፍትሄ ሁኔታዎች44።በ TCCD ፍንዳታ ትንታኔ (ምስል 7c, የላይኛው ፓነል) ውህደቶቹን ስንመረምር, በእያንዳንዱ ገለልተኛ ድምር (αS/Tau heteroaggregate) ውስጥ 60% የሚሆኑት የተገኙት ስብስቦች αS እና ታው ሁለቱንም ይይዛሉ, 30% ያህሉ ብቻ ይይዛሉ. tau፣ ወደ 10% αS ብቻ።የ αS/Tau heteroaggregates ስቶይቺዮሜትሪክ ትንታኔ እንደሚያሳየው አብዛኛው heteroaggregates በ tau (ስቶይቺዮሜትሪ ከ 0.5 በታች ፣ አማካይ የ tau ሞለኪውሎች ብዛት ከ αS ሞለኪውሎች በ 4 እጥፍ ይበልጣል) ፣ ይህም በቦታው በ FLIM ውስጥ ከሚታየው ሥራችን ጋር የሚስማማ ነው ። ሙከራዎች..የ FRET ትንታኔ እንደሚያሳየው እነዚህ ውህዶች ሁለቱንም ፕሮቲኖች እንደያዙ ነው ፣ ምንም እንኳን በዚህ ጉዳይ ላይ ትክክለኛው የ FRET እሴቶች ትልቅ ጠቀሜታ ባይኖራቸውም ፣ በእያንዳንዱ ድምር ውስጥ የፍሎሮፎሮች ስርጭት በዘፈቀደ የተደረገ በሙከራው ውስጥ ጥቅም ላይ ያልዋለ ፕሮቲን ከመጠን በላይ ስለሆነ።የሚገርመው ነገር፣ 45,46 የጎለመሱ አሚሎይድ አጎራባች እጥረት ታው ልዩነትን በመጠቀም ተመሳሳይ ትንታኔ ስናደርግ (ተጨማሪ ምስል 11a,b ይመልከቱ) ምንም እንኳን የ αS ኤሌክትሮስታቲክ ስብስብ ተመሳሳይ ቢሆንም (ተጨማሪ ምስል 11c, d) አስተውለናል. በ coacervate ውስጥ ድምርን የመፍጠር ችሎታ በጣም ቀንሷል እና FLIM በቦታው ሙከራዎች ውስጥ በርካታ ቦታዎችን አግኝቷል እና ደካማ የዝውውር ኩርባዎች ለገለልተኛ ድምር ናሙናዎች ተስተውለዋል።ነገር ግን፣ ለተገኙ ጥቂት ውህዶች (ከTau441 አንድ አስረኛ ብቻ)፣ እያንዳንዱ ድምር በαS የበለፀገ መሆኑን ከዚህ ታው ልዩነት ውስጥ፣ በግምት 50% የሚሆኑት የተገኙት αS ሞለኪውሎች ብቻ የያዙ እና αS ከመጠን በላይ የተለያየ እንደሆነ አስተውለናል። .ድምር (ተጨማሪ ምስል 11e ይመልከቱ), በ Tau441 (ምስል 6f) ከተፈጠሩት የተለያዩ ስብስቦች በተቃራኒው.የእነዚህ ሙከራዎች ውጤቶች እንደሚያሳዩት ምንም እንኳን αS እራሱ በ coacervate ውስጥ ከ tau ጋር መከማቸት ቢችልም, በእነዚህ ሁኔታዎች ውስጥ ታው ኑክሊየሽን የበለጠ ምቹ ነው, እና በዚህ ምክንያት አሚሎይድ የሚመስሉ ስብስቦች እንደ αS እና tau አይነት መስራት ይችላሉ.ነገር ግን፣ አንዴ ታው-ሀብታም ኮር ከተፈጠረ፣ በ αS እና ታው መካከል ያሉ ሄትሮታይክቲክ ግንኙነቶች በ tau ሞለኪውሎች መካከል ባለው ግብረ ሰዶማዊ ግንኙነቶች ላይ በድምሩ ተመራጭ ናቸው።በፈሳሽ αS/tau coacervates ውስጥ የፕሮቲን ኔትወርኮችን እናስተውላለን።
በ αS/Tau441 ኤሌክትሮስታቲክ ኮአሰርቫትስ ውስጥ የተፈጠሩ ነጠላ ሞለኪውሎች የነጠላ ድምር ጊዜያዊ ፍሎረሰንሰን።ከ αS/Tau441 coaggregates ጋር የሚዛመዱ ፍንዳታዎች (ከተጠቆመው ገደብ በላይ ያሉ ፍንዳታዎች) በሶስት የፍተሻ ቻናሎች (AF488 እና Atto647N ልቀት ከቀጥታ መነቃቃት በኋላ፣ ሰማያዊ እና ቀይ መስመሮች፣ ከተዘዋዋሪ መነሳሳት በኋላ Atto647N ልቀት)፣ FRET፣ ቫዮሌት መስመር)።b FCS/FCCS ከLLPS (የግራ ፓነል) የተገኘ የነጠላ αS/Tau441 ድምር ናሙና ትንተና።የ AF488 እና Atto647N አውቶኮርሬሌሽን (AC) ኩርባዎች በቅደም ተከተል በሰማያዊ እና በቀይ ይታያሉ ፣ እና መስቀል-ኮርረሬሽን (CC) ኩርባዎች ሁለቱንም ቀለሞች ከያዙ ድምርችት ጋር ተያይዘው ይታያሉ።የኤሲ ኩርባዎቹ ሞኖሜሪክ እና የተዋሃዱ የፕሮቲን ዓይነቶች መኖራቸውን የሚያንፀባርቁ ሲሆን የሲሲሲ ኩርባዎች ደግሞ ድርብ ምልክት የተደረገባቸው ስብስቦች ስርጭትን ብቻ ያሳያሉ።ተመሳሳይ ትንታኔ, ነገር ግን በተለዩ ቦታዎች ላይ ተመሳሳይ የመፍትሄ ሁኔታዎች, ሞኖሜሪክ αS እና Tau441 ብቻ የያዙ ናሙናዎች በትክክለኛው ፓነል ውስጥ እንደ መቆጣጠሪያዎች ይታያሉ.c Fluorescence ፍላሽ ትንተና በ αS/Tau441 electrostatic coacervates ውስጥ የተፈጠሩ ነጠላ ሞለኪውሎች የተገለሉ ስብስቦች።በአራት የተለያዩ ድግግሞሾች (N = 152) የተገኘው ለእያንዳንዱ ድምር መረጃ በስቶይቺዮሜትሪ፣ በኤስ እሴቶች እና በ FRET ቅልጥፍናቸው ላይ ተቀርጿል (የላይኛው ፓነል፣ የቀለም አሞሌ ክስተትን ያንፀባርቃል)።ሶስት ዓይነት ድምር ዓይነቶችን መለየት ይቻላል፡-αS-ብቻ ድምር ከS~1 እና FRET~0፣Tau-only aggregates with S~0 እና FRET~1፣እና የተለያዩ Tau/αS ከመካከለኛ S እና FRET ጋር የገንዘቡን ግምት በእያንዳንዱ የተለያየ ድምር (N = 100) የተገኙት የሁለቱም ማርከር ፕሮቲኖች በታችኛው ፓነል ላይ ይታያሉ (የቀለም መለኪያው ክስተትን ያንፀባርቃል)።ጥሬ መረጃ የሚቀርበው በጥሬ መረጃ ፋይሎች መልክ ነው።
የፈሳሽ ፕሮቲን ብስለት ወይም እርጅና ከጊዜ ወደ ጊዜ ወደ ጄል-መሰል ወይም ጠጣር አወቃቀሮች ይዋሃዳል condensate47 እና በበሽታዎች ላይ በርካታ የፊዚዮሎጂ ተግባራት ውስጥ እንደሚሳተፍ ተዘግቧል። የደረጃ መለያየትን እና ባህሪን በዝርዝር እናጠናለን።LSPT αS ቁጥጥር ባለበት አካባቢ በዝቅተኛ የማይክሮሞላር ክምችት እና ከፊዚዮሎጂ ጋር ተያያዥነት ባላቸው ሁኔታዎች ውስጥ የዘፈቀደ ፖሊኬሽን ሲኖር (የ αS የተሰላ የፊዚዮሎጂ ትኩረት > 1 µM50 መሆኑን ልብ ይበሉ)፣ የ LPS ዓይነተኛ በቴርሞዳይናሚካላዊ የሚመራ ባህሪን በመከተል።በፊዚዮሎጂ ፒኤች ላይ በጣም አሉታዊ በሆነ ሁኔታ የ C-terminal ክልልን የያዘው αS እንደ pLK ወይም ታው ያሉ በኤሌክትሮስታቲክ ሂደት ውስጥ ከፍተኛ cationic የተዘበራረቁ peptides ባሉበት በኤልኤልፒኤስ በኩል በፕሮቲን የበለፀጉ ጠብታዎችን በውሃ መፍትሄ መፍጠር እንደሚችል ደርሰንበታል። የተጠራቀሙ ማክሮ ሞለኪውሎች ባሉበት ውስብስብ ኮንደንስ.ይህ ሂደት αS ከበሽታ ጋር የተያያዙ የተለያዩ ፖሊኬቲክ ሞለኪውሎችን በብልቃጥ እና በ vivo51,52,53,54 ውስጥ ከሚገኙት የተለያዩ ፖሊኬቲክ ሞለኪውሎች ጋር በሚገናኝበት ሴሉላር አካባቢ ላይ ጠቃሚ ተጽእኖ ሊኖረው ይችላል.
በብዙ ጥናቶች ውስጥ፣ በነጠብጣቦች ውስጥ ያለው የፕሮቲን ተለዋዋጭነት የመብሰል ሂደትን ከሚወስኑት ቁልፍ ነገሮች አንዱ ተደርጎ ተወስዷል55,56.በኤሌክትሮስታቲክ αS ከ polycations ጋር ሲተባበር፣ የብስለት ሂደቱ በግልጽ እንደሚታየው ከፖሊኬሽን ጋር ባለው መስተጋብር ጥንካሬ፣ በቫሌንስ እና በእነዚህ መስተጋብሮች ብዜት ላይ ነው።የተመጣጠነ ንድፈ ሐሳብ እንደሚያሳየው የሁለት ፈሳሽ ግዛቶች ሚዛናዊ ገጽታ LLPS57,58 የሚያሽከረክር ባዮፖሊመሮች የበለፀገ ትልቅ ጠብታ መኖር ነው።ጠብታ ዕድገት በኦስትዋልድ maturation59፣ coalescence60 ወይም በነጻ ሞኖመር ፍጆታ በተበታተነው phase61 ሊገኝ ይችላል።ለ αS እና Tau441, ΔNt-Tau ወይም pLK, አብዛኛው ፕሮቲን በዚህ ጥናት ውስጥ ጥቅም ላይ በሚውሉ ሁኔታዎች ውስጥ በኮንደንስ ውስጥ ተከማችቷል.ነገር ግን፣ ሙሉ መጠን ያላቸው ታው ጠብታዎች በገጸ-እርጥበት ላይ በፍጥነት ሲዋሃዱ፣ የነጠብጣብ ውህደት እና እርጥበታማነት ለ ΔNt-Tau እና pLK አስቸጋሪ ነበሩ፣ ይህም በሁለቱ ስርአቶች ውስጥ የፈሳሽ ንብረቶችን በፍጥነት ማጣትን ይጠቁማል።እንደ FLIM-FRET ትንታኔያችን፣ ያረጁ pLK እና ΔNt-Tau ጠብታዎች እንደ ኦሪጅናል ጠብታዎች ተመሳሳይ የሆነ የፕሮቲን ውህደትን (ተመሳሳይ የፍሎረሰንስ የህይወት ዘመን) አሳይተዋል፣ ይህም ዋናው የፕሮቲን አውታር ተጠብቆ የነበረ ቢሆንም የበለጠ ጥብቅ ቢሆንም።
የሙከራ ውጤቶቻችንን በሚከተለው ሞዴል (ስእል 8) እናሳያለን.መጀመሪያ ላይ በጊዜያዊነት የተፈጠሩት ጠብታዎች ብዙውን ጊዜ ኤሌክትሮስታቲክ ማካካሻ የሌላቸው የፕሮቲን ኔትወርኮች ናቸው, ስለዚህም የኃይል ክፍያ አለመመጣጠን ቦታዎች አሉ, በተለይም በ droplet በይነገጽ ላይ, ይህም ከፍተኛ ኤሌክትሮስታቲክ ወለል እምቅ ጠብታዎችን ያስከትላል.ክፍያን ለማካካስ (በተለምዶ የቫሌንስ መመናመን ተብሎ የሚታወቀው ክስተት) እና የነጠብጣቦቹን ወለል እምቅ አቅም ለመቀነስ፣ ጠብታዎቹ አዲስ ፖሊፔፕቲዶችን ከዲሉቱ ክፍል ውስጥ ሊያካትቱ፣ የፕሮቲን ኔትወርኮችን እንደገና በማደራጀት የኃይል መሙያ መስተጋብርን ለማመቻቸት እና ከሌሎች ጠብታዎች ጋር መስተጋብር መፍጠር ይችላሉ።ከንጣፎች (እርጥበት) ጋር.የ αS/pLK ጠብታዎች በቀላል የፕሮቲን አውታርታቸው (በ αS እና pLK መካከል ያሉ ሄትሮታይክቲክ ግንኙነቶች ብቻ) እና ለፕሮቲን-ፕሮቲን መስተጋብር የበለጠ ቅርበት ያላቸው በመሆኑ የኮንደሴቱን ክፍያ በፍጥነት ማመጣጠን የሚችሉ ይመስላል።በእርግጥ፣ በመጀመሪያ ከተፈጠሩት αS/pLK coacervates αS/ታው ይልቅ ፈጣን የፕሮቲን ኪነቲክስን አስተውለናል።ከቫሌንስ መሟጠጥ በኋላ ግንኙነቶቹ ከጊዜ ወደ ጊዜ እየቀነሱ ይሄዳሉ እና ጠብታዎቹ የፈሳሽ ባህሪያቶቻቸውን ያጣሉ እና ወደ ጄል-መሰል ፣ ተቀጣጣይ ያልሆኑ ጠብታዎች እና ዝቅተኛ ኤሌክትሮስታቲክ ወለል አቅም ያላቸው (ስለዚህ መሬቱን ማራስ አይችሉም) ይሆናሉ።በአንፃሩ፣ αS/ታው ጠብታዎች ጠብታ ቻርጅ ሚዛንን ለማመቻቸት በጣም ውስብስብ የፕሮቲን ኔትወርኮች (ከሁለቱም ግብረ ሰዶማዊ እና ሄትሮታይፒክ ግንኙነቶች ጋር) እና የፕሮቲን መስተጋብር ደካማ ባህሪ ስላላቸው ውጤታማ አይደሉም።ይህ ረዘም ላለ ጊዜ ፈሳሽ ባህሪን የሚይዙ እና ከፍተኛ ኤሌክትሮስታቲክ ወለል እምቅ አቅምን የሚያሳዩ ጠብታዎችን በማፍለቅ እና በማደግ (በመሆኑም የነጠብጣቦቹን የንጣፍ ስፋት/የድምፅ ሬሾን በመቀነስ) እና የሃይድሮፊል ወለል ኬምን ማርጠብ።ይህ በፕሮቲን አውታር ውስጥ ባለው የማያቋርጥ ክፍያ ማመቻቸት ምክንያት ግንኙነቶቹ በጣም ጊዜያዊ ስለሚሆኑ ፈሳሽ ባህሪያትን የሚይዙ ትላልቅ የተከማቸ የፕሮቲን ቤተ-መጽሐፍትን ይፈጥራል።የሚገርመው ነገር፣ N-terminally የተቆራረጡ የታው ዓይነቶች፣ አንዳንድ በተፈጥሮ የሚገኙ isoforms62ን ጨምሮ፣ መካከለኛ ባህሪን ያሳያሉ፣ አንዳንድ ከ αS ጋር እርጅናን ወደ ረጅም ጄል-መሰል ጠብታዎች ያባብሳሉ ፣ ሌሎች ደግሞ ወደ ትልቅ ፈሳሽ ኮንዳንስ ይለወጣሉ።ይህ በ αS ኤሌክትሮስታቲክ ኮአሰርቬትስ ብስለት ላይ ያለው ድርብነት የኮንደንስተስ መጠንን እና የፈሳሽ ባህሪያትን ለመቆጣጠር እንደ ቁልፍ በቫሌንስ መመናመን እና በኤሌክትሮስታቲክ ወንፊት መካከል ያለውን ትስስር ለይተው ካወቁ የኤልኤልፒኤስ ቲዎሬቲካል እና የሙከራ ጥናቶች ጋር የሚስማማ ነው።ሜካኒዝም 58.61.
ይህ እቅድ ለ αS እና Tau441 በ LLPS እና LSPT በኩል የ putative amyloid aggregation ዱካ ያሳያል።ተጨማሪ አኒዮን-ሀብታም (ቀይ) እና cation-የበለጸጉ (ሰማያዊ) ክልሎች ጋር, αS እና tau electrostatic coacervates አጥጋቢ valence ጋር ወለል ኃይል ዝቅተኛ እና ስለዚህ ያነሰ coalescence, በዚህም ፈጣን ጠብታ እርጅና ያስከትላል.የተረጋጋ ያልተጋነነ የጄል ሁኔታ ተገኝቷል..ይህ ሁኔታ በ αS / pLK ስርዓት ውስጥ በጣም ምቹ ነው, ምክንያቱም ከፍ ባለ ቅርበት እና ቀላል የፕሮቲን-ጥንድ መስተጋብር አውታር, ይህም ፈጣን ጄል-መሰል ሽግግር እንዲኖር ያስችላል.በተቃራኒው አጥጋቢ ያልሆነ የቫሌንስ ጠብታዎች እና በፕሮቲን የተሞሉ ክልሎች ለግንኙነት ዝግጁ ናቸው, ኮአሰርቫት ከፍተኛ የገጽታ ኃይሉን ለመቀነስ የሃይድሮፊሊካዊውን ወለል እንዲዋሃድ እና እንዲረጥብ ያደርገዋል።ይህ ሁኔታ ለ αS/Tau441 coacervates ተመራጭ ነው፣ ደካማ ታው-ታው እና αS-ታው መስተጋብሮችን ያቀፈ ሁለገብ ውስብስብ አውታረ መረብ አላቸው።በምላሹ፣ ትላልቅ ኮአሰርቫቶች ፈሳሽ መሰል ባህሪያቸውን በቀላሉ ይይዛሉ፣ ይህም ሌሎች ከፕሮቲን ወደ ፕሮቲን መስተጋብር እንዲፈጠር ያስችላቸዋል።ውሎ አድሮ፣ ሁለቱም ኤኤኤስ እና ታው የያዙ አሚሎይድ ሄትሮጂንስ ስብስቦች በ coacervate ፈሳሽ ውስጥ ይመሰረታሉ፣ እነዚህም በነርቭ ዲጄኔሬቲቭ በሽታዎች መለያ ከሆኑት በማካተት አካላት ውስጥ ካሉት ጋር ሊዛመዱ ይችላሉ።
በ αS/Tau441 ብስለት ወቅት የተፈጠሩት ትላልቅ ፈሳሽ መሰል አወቃቀሮች በጣም በተጨናነቀ ነገር ግን ተለዋዋጭ የሆነ የፕሮቲን አካባቢ እና በመጠኑም ቢሆን αS/ΔNt-Tau coacervates ለፕሮቲን ውህደት ኒውክሊየሽን ተስማሚ የውሃ ማጠራቀሚያዎች ናቸው።በዚህ አይነት የፕሮቲን ኮአሰርቬትስ ውስጥ ጠንካራ የፕሮቲን ስብስቦች ሲፈጠሩ ተመልክተናል፣ ብዙ ጊዜ ሁለቱንም αS እና ታው ይይዛሉ።እነዚህ heteroaggregates በኤሌክትሮስታቲክ ባልሆኑ መስተጋብሮች የተረጋጉ መሆናቸውን አሳይተናል፣ አሚሎይድ-ተኮር የሆኑ ThT ቀለሞችን ልክ እንደ ዓይነተኛ አሚሎይድ ፋይብሪሎች በተመሳሳይ መንገድ ማሰር እንደሚችሉ እና በእርግጥ ለተለያዩ ተጽዕኖዎች ተመሳሳይ የመቋቋም ችሎታ እንዳላቸው አሳይተናል።በኤልኤልፒኤስ የተፈጠሩት αS/tau ድምር አሚሎይድ መሰል ባህሪያት እንዳላቸው ታይቷል።በእርግጥ፣ በፈሳሽ ኤሌክትሮስታቲክ ኮአሰርቫት ውስጥ እነዚህ የተለያዩ የ αS ውህዶች በሚፈጠሩበት ጊዜ የአሚሎይድ ውህደት የጎደለው የታው ጎልማሳ ልዩነት በከፍተኛ ሁኔታ ተጎድቷል።የ αS/Tau441 ውህዶች መፈጠር የሚታየው በ coacervates ውስጥ ብቻ ነው ፣ ይህም ፈሳሽ የሚመስሉ ንብረቶችን ይይዛል ፣ እና በጭራሽ ፣ ኮአሰርቫት / ነጠብጣቦች ወደ ጄል ሁኔታ ካልደረሱ።በኋለኛው ጊዜ የኤሌክትሮስታቲክ ግንኙነቶች ጥንካሬ መጨመር እና በዚህ ምክንያት የፕሮቲን አውታር ጥብቅነት ለአሚሎይድ ኒውክሊየስ አስፈላጊ የሆኑ አዲስ የፕሮቲን ግንኙነቶችን ለመመስረት የፕሮቲኖች አስፈላጊ የሆኑትን የተጣጣሙ ማስተካከያዎችን ይከላከላል.ነገር ግን ይህ በተለዋዋጭ፣ ፈሳሽ በሚመስሉ ኮአሰርቫቶች ውስጥ ሊገኝ ይችላል፣ ይህ ደግሞ መጠናቸው እየጨመረ ሲሄድ ፈሳሽ የመቆየት ዕድላቸው ከፍተኛ ነው።
በፍጥነት ጄል ከሚሆኑ ትናንሽ ጠብታዎች ይልቅ በትልቅ αS/ታው condensates ውስጥ በኮንደንሰንት ደረጃ ውስጥ ያሉ ውህዶች መፈጠር ተመራጭ መሆናቸው የጠብታ ውህደትን የሚቆጣጠሩትን ነገሮች የመለየት አስፈላጊነትን ያሳያል።ስለዚህ, ደረጃ የመለየት አዝማሚያ ብቻ ሳይሆን, የኮንደሴቱ መጠን ለትክክለኛ አሠራር እና በሽታን ለመከላከል ቁጥጥር ሊደረግበት ይገባል58,61.ውጤታችን በተጨማሪም በኤልኤልፒኤስ እና በ LSPT መካከል ያለው ሚዛን ለ αS/ታው ስርዓት ያለውን ጠቀሜታ ያጎላል።ነጠብጣብ መፈጠር በሙሌት ሁኔታዎች ውስጥ የሚገኙትን የፕሮቲን ሞኖመሮች መጠን በመቀነስ ከአሚሎይድ ውህደት ሊከላከል ይችላል፣በሌሎች ሲስተሞች63,64 ላይ እንደቀረበው፣ከፍተኛ ጠብታዎች ላይ ያለው ጠብታ ውህደት በዝግታ የተስተካከሉ ማሻሻያዎችን በማድረግ ወደ ውስጣዊ ፕሮቲን ውህደት ሊያመራ ይችላል።የፕሮቲን አውታሮች..
በአጠቃላይ፣ የኛ መረጃ በ LSPT አውድ ውስጥ በተቆልቋይ ኔትወርኮች ውስጥ የተቀናጀ valence እና እርካታ/ያልተደሰተ መስተጋብር አስፈላጊነትን አጥብቆ ያጎላል።በተለይም ባለ ሙሉ ርዝመት αS/Tau441 ኮንደንስተሮች ሁለቱንም ፕሮቲኖች የሚያካትቱ እና ሞለኪውላዊ ዘዴን የሚያቀርቡ አሚሎይድ የሚመስሉ ሄትሮአግግሬጌቶችን በብቃት በማዋሃድ እና ኒውክላይላይት ማድረግ እንደሚችሉ እናሳያለን።እዚህ የምንዘግበው የሁለት ፕሮቲኖች αS/ታው ፈሳሽ ኮአሰርቫት ውስጥ ያለው ውህደት የበሽታው መለያ ከሆኑት ሁለት ፕሮቲኖች ጋር አብሮ ከመገኛ ጋር የተያያዘ ሊሆን ይችላል እና በኤልኤልፒኤስ እና በኤልኤልፒኤስ መካከል ያለውን ግንኙነት ለመረዳት ይረዳል። amyloid aggregation, በኒውሮዲጄኔሽን ውስጥ ከፍተኛ ኃይል ላለው IDP መንገድ ይከፍታል.
ሞኖሜሪክ WT-αS, ሳይስቴይን ሚውቴሽን (Q24C-αS, N122C-αS) እና ΔCt-αS ልዩነቶች (Δ101-140) በ E. ኮላይ ውስጥ ተገልጸዋል እና ቀደም ሲል እንደተገለፀው ተጣሩ.የዲሰልፋይድ ቦንድ መፈጠርን ለመከላከል 5 ሚሜ ዲቲቲ በሁሉም የ αS ሳይስቴይን ሚውቴሽን ንፅህና ውስጥ ተካቷል።Tau441 መመለሻ (ፕላዝጊድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድታይታቲክቲክቲካቲካቲክታታታታቲክታታታታቲክታቲካቲክታታታቲክታታታቲካ er) e. Coi ባህሎች ነበሩ ወደ OD600 = 0.6-0.7 በ 37 ° C እና 180 rpm, እና አገላለጽ በአይፒቲጂ ለ 3 ሰዓታት በ 37 ° ሴ ተነሳሳ.የመኸር ሴሎችን በ 11,500 xg ለ 15 ደቂቃ በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ እና 150 mM NaCl በያዘው የሳሊን መያዣ ይታጠቡ.እንክብሉን በሊሴስ ቋት ውስጥ እንደገና ማንጠልጠል (20 ml በ 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin).1.የ sonication እርምጃ በረዶ ላይ 80% አንድ amplitude ለ 10 ምት (1 ደቂቃ በርቷል, 1 ደቂቃ ጠፍቷል).በአንድ አልትራሳውንድ ውስጥ ከ 60 ሚሊ ሜትር አይበልጡ.E.coli lysates በ 95 ° C. ለ 20 ደቂቃዎች ይሞቃሉ, ከዚያም በበረዶ ላይ ይቀዘቅዛሉ እና በ 127,000 × g ለ 40 ደቂቃዎች ሴንትሪፈፍ.የተብራራዉ ሱፐርናታንት በ 3.5 kDa membrane (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) ላይ ተተግብሯል እና በ 4 L የዲያሊሲስ ቋት (20 ሚሜ MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM). , PMSF 0.1 mM) ለ 10 ሰአታት.የ 5 ml cation exchange አምድ (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ከተመጣጣኝ ቋት (20 ሚሜ MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) ጋር ተስተካክሏል.የ tau lysate በ 0.22 μm PVDF ማጣሪያ ውስጥ ተጣርቶ በ 1 ml / ደቂቃ ፍሰት መጠን ወደ አምድ ውስጥ ገብቷል.Elution ቀስ በቀስ ተካሂዷል, ታው በ 15-30% elation buffer (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) ተዘርግቷል.ክፍልፋዮች በኤስዲኤስ-ገጽ የተተነተኑ ሲሆን የሚጠበቀው የታው ሞለኪውላዊ ክብደት ያለው አንድ ባንድ የያዙ ማንኛቸውም ክፍልፋዮች 10 kDa centrifuge ማጣሪያ በመጠቀም አተኩረው 10 ሚሜ HEPES፣ pH 7.4፣ NaCl 500 mM እና DTT 2 mM በያዘ ቋት ተተክተዋል። የመጨረሻው የፕሮቲን መጠን 100 μM ነበር.ከዚያም የፕሮቲን መፍትሄ በ 0.22 μm PVDF ማጣሪያ ውስጥ ተላልፏል, በፍጥነት በረዶ እና በ -80 ° ሴ.ፕሮቲን K18 በደግነት በፕሮፌሰር አልቤርቶ ቦፊ ቀረበ።በኤስዲኤስ-ገጽ እና ማልዲ-ቶፍ/TOF እንደተረጋገጠው የዝግጅቱ ንፅህና>95% ነበር።የተለያዩ ሳይስቲን በኬሚካላዊ ምልክት በ AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) ወይም TEMPOL-maleimide (ቶሮንቶ ምርምር ኬሚካሎች, ቶሮንቶ, ካናዳ).በመምጠጥ እና በMALDI-TOF/TOF ተረጋግጠዋል።ታው441፣ ΔNt-ታው፣ AggDef-ታው እና K18 በተመሳሳይ አሰራር Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) ን በመጠቀም በ 191 እና 322 በቦታዎች የሳይስቴይን ቅሪቶች ተለጥፈዋል።ለ αS እና Tau441 ለቅሪ ካርታዎች የተጣራ ክፍያ የተፈጠረው CIDER66ን በመጠቀም ነው።
ድፍን ፖሊ-ኤል-ላይሲን (pLK DP 90-110 ከአቅራቢው እንደ NMR, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) በ 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 እስከ 10 mM ማጎሪያ, ሂደት ለ 5 sonicated ነበር. ደቂቃዎች በአልትራሳውንድ የውሃ መታጠቢያ ውስጥ እና በ -20 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ያከማቹ።PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) እና FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) በውሃ የሚሟሟ እና በኤልኤልፒኤስ ቋት ውስጥ በሰፊው ተሰራጭተዋል።ዳያሊሲስ የተበከሉ ጨዎችን ያስወግዳል.ከዚያም 0.22 μm የሆነ ቀዳዳ ባለው መርፌ ማጣሪያ ውስጥ ተጣርተዋል, እና ትኩረታቸው በ refractometer (ሜትለር ቶሌዶ, ኮሎምበስ, ኦሃዮ, አሜሪካ) በመጠቀም ይሰላል.የኤልኤልፒኤስ ናሙናዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ በሚከተለው ቅደም ተከተል ተዘጋጅተዋል፡ ቋት እና ማስወጣት ተቀላቅለዋል እና 1 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) እና 1% ፕሮቲን መከላከያ (PMSF 100 mM, benzamide 1 mM, leupeptin 5 μM) ድብልቅ.ከዚያም αS እና fusesed polycations (አማራጮች pLK ወይም Tau) ተጨምረዋል።ለቲዮፍላቪን-ቲ ተከታታይ ሙከራዎች (ThT, Carbosynth, Compton, UK) አጠቃላይ የ ThT ትኩረትን የ αS ትኩረትን ግማሽ እንዲሆን ይጠቀሙ።ናሙናዎቹ ተመሳሳይ መሆናቸውን ለማረጋገጥ በእርጋታ ግን በደንብ ይቀላቅሉ።በውጤቶች ክፍል ላይ እንደተገለጸው የእያንዳንዱ አካል ትኩረት ከሙከራ ወደ ሙከራ ይለያያል።የሙከራው የቆይታ ጊዜ ከ4 ሰአታት በላይ በሆነ ጊዜ አዚድ በ 0.02% (w/v) መጠን ጥቅም ላይ ውሏል።የኤልኤልፒኤስ ናሙናዎችን ለሚጠቀሙ ሁሉም ትንታኔዎች ድብልቅው ከመተንተን ለ 5 ደቂቃዎች ያህል እንዲመጣጠን ይፍቀዱ።ለብርሃን መበታተን ትንተና፣ 150 µl ናሙናዎች አስገዳጅ ባልሆኑ ባለ 96-ጉድጓድ ማይክሮፕሌቶች (µClear®, black, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) ላይ ተጭነዋል እና በማጣበቂያ ፊልም ተሸፍነዋል።ኤልኤልፒዎች በ CLARIOstar ሳህን አንባቢ (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) ውስጥ በመፍትሔው መሃል ላይ በ 350 nm የመጠጣትን መጠን በመለካት ቁጥጥር ይደረግባቸዋል.ሙከራዎቹ በሶስት እጥፍ በ 25 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ የተካሄዱ ሲሆን ስህተቶቹ ከአማካይ መደበኛ ልዩነት ይሰላሉ.የዲሉቱ ደረጃ በናሙና ሴንትሪፉግሽን እና በኤስዲኤስ-ገጽ ጄል ትንተና የተሰላ ሲሆን በዲሉቱ እና በተጠራቀሙ ደረጃዎች ውስጥ ያለው የ αS ክፍልፋይ በተለያዩ የኤልኤልፒኤስ መፍትሄዎች ተወስኗል።1 μM AF488-Labeled αS የያዘ 100 μl LLPS ናሙና በደንብ በመደባለቅ ተዘጋጅቶ በ9600×g ሴንትሪፍግሽን ለ 30 ደቂቃዎች ተዘጋጅቷል፣ከዚያም የዝናብ መጠኑ በብዛት ይታያል።የከፍተኛው 50 μl የ SDS-PAGE ጄል በመጠቀም ለፕሮቲን መጠን ጥቅም ላይ ውሏል።ጄል በ AF488 ማጣሪያዎች የተቃኘው የኬሚዶክ ጄል ኢሜጂንግ ሲስተም (ባዮ-ራድ ላቦራቶሪዎች፣ ሄርኩለስ፣ ካሊፎርኒያ፣ ዩኤስኤ) በመጠቀም ወይም በኮማሴ እድፍ የተበከሉ እና በተገቢው ማጣሪያዎች የታዩ ናቸው።የተገኙት ባንዶች ImageJ ስሪት 1.53i (ብሔራዊ የጤና ተቋማት፣ ዩኤስኤ) በመጠቀም ተንትነዋል።ሙከራዎቹ ተመሳሳይ ውጤት ባላቸው ሁለት የተለያዩ ሙከራዎች በተባዛ ተካሂደዋል።
በተለምዶ 150 μl ናሙናዎች አስገዳጅ ባልሆኑ 96-ጉድጓድ ማይክሮፕሌቶች ላይ ተተግብረዋል እና በክፍሉ የሙቀት መጠን በሊይካ DMI6000B በተገለበጠ ማይክሮስኮፕ (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) ላይ ይታያሉ.ለቦታ ሙከራዎች፣µ-ስላይድ አንጂኦጄኔሲስ ፕሌትስ (Ibidi GmbH፣ Gräfelfing፣ ጀርመን) ወይም 96-well polystyrene microplates (Corning Costar Corp.፣ Acton፣ Massachusetts) እንዲሁ ጥቅም ላይ ውለዋል።EL6000 halogen ወይም የሜርኩሪ ብረት ሃሎይድ መብራቶች እንደ ብርሃን ምንጮች (ለ BF/DIC እና WF ኢሜጂንግ በቅደም ተከተል) ጥቅም ላይ ውለዋል።ለደብልዩኤፍ ማይክሮስኮፒ፣ 40x የማጉላት አየር ዓላማ (Leica Microsystems፣ Germany) ብርሃኑን በናሙናው ላይ ለማተኮር እና ለመሰብሰብ ጥቅም ላይ ውሏል።ለ AF488 እና ThT ምልክት የተደረገባቸው ናሙናዎች፣ አበረታች እና ልቀትን ከመደበኛ የጂኤፍፒ ማጣሪያ ስብስቦች፣ አበረታች እና ልቀት የባንድፓስ ማጣሪያዎች በቅደም ተከተል 460-500 nm እና 512–542 nm bandpass ማጣሪያዎች፣ እና 495 nm dichroic mirror።በ Atto647N ለተሰየሙ ናሙናዎች መደበኛ የCy5 ማጣሪያዎች ከ628-40 nm እና 692-40 nm እና 660 nm dichroic mirror ጋር ጥቅም ላይ ውለዋል።ለBF እና DIC አጉሊ መነጽር፣ ተመሳሳይ የተንጸባረቀ የብርሃን መሰብሰብ አላማ ይጠቀሙ።የተሰበሰበው ብርሃን የተቀዳው በሌይካ DFC7000 ሲሲዲ ካሜራ (Leica Microsystems፣ Germany) ነው።የተጋላጭነት ጊዜ 50 ms ለ BF እና DIC ማይክሮስኮፒ ኢሜጂንግ እና 20-100 ms ለደብልዩኤፍ ማይክሮስኮፒ ምስል ነው።ለማነጻጸር፣ በThT ላይ የተደረጉ ሁሉም ሙከራዎች የተጋላጭነት ጊዜ 100 ሚሴ ነበር።በየ100 ሚሴ ለብዙ ደቂቃዎች ምስሎች እየተሰበሰቡ የጠብታ ውህደትን በዓይነ ሕሊና ለማየት ጊዜ ያለፈባቸው ሙከራዎች ተካሂደዋል።ImageJ (NIH, USA) ምስልን ለመተንተን ጥቅም ላይ ውሏል.ሙከራዎቹ በተመሳሳይ ውጤት በሶስት እጥፍ ተካሂደዋል.
ለኮሎካልላይዜሽን ሙከራዎች፣ FRAP እና 3D መልሶ ግንባታ፣ ምስሎች በZEN 2 ሰማያዊ እትም (ካርል ዜይስ AG፣ Oberkochen፣ Germany) በመጠቀም በZiss LSM 880 በተገለበጠ ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ ላይ ተገኝተዋል።የ50 µl ናሙናዎች በµ-ስላይድ Angiogenesis Petri ምግቦች (Ibidi GmbH፣ Gröfelfing፣ ጀርመን)፣ በሃይድሮፊል ፖሊመር (ibiTreat) መታከም እና በ63× የዘይት ጥምቀት ዓላማ (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) ላይ ተተግብረዋል። በ DIC)።ምስሎች የተገኙት 458 nm፣ 488 nm እና 633 nm argon laser lines በ 0.26 μm/pixel ጥራት እና 8 μs/pixel የተጋላጭነት ጊዜ ለ 470-600 nm፣ 493-628 nm አበረታች እና ልቀት መፈለጊያ መስኮቶች፣ እና 638-755 nm ThTን፣ AF488 እና Atto647Nን በቅደም ተከተል ለማሳየት ጥቅም ላይ ውሏል።ለ FRAP ሙከራዎች የእያንዳንዱ ናሙና ጊዜ ያለፈበት ፎቶግራፍ በሴኮንድ 1 ፍሬም ተመዝግቧል።ሙከራዎቹ በክፍል ሙቀት ውስጥ በሶስት እጥፍ ተካሂደው ተመሳሳይ ውጤት አግኝተዋል.ሁሉም ምስሎች የዜን 2 ሰማያዊ እትም ሶፍትዌር (ካርል ዜይስ AG፣ Oberkochen፣ ጀርመን) በመጠቀም ተንትነዋል።OriginPro 9.1 ን በመጠቀም Zen 2 ን በመጠቀም የ FRAP ኩርባዎች መደበኛ፣ የተነደፉ እና ከጥንካሬ/የጊዜ ውሂብ ጋር የተገጣጠሙ ናቸው።የማገገሚያ ኩርባዎች ለሞለኪውላዊ ስርጭት ከተጨማሪ ገላጭ ቃል ጋር ለግዢው የመጥፋት ውጤትን ለመቁጠር ከአንድ ሞኖ ገላጭ ሞዴል ጋር ተጭነዋል።በመቀጠልም እንደ ካንግ እና ሌሎች እኩልዮሽ የሆነውን የነጣው ራዲየስ እና ቀደም ሲል የተወሰነውን የመልሶ ማግኛ ግማሽ ህይወት በመጠቀም D እናሰላለን።5 35 ታይቷል።
ነጠላ የሳይስቴይን ዓይነቶች αS ከ4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) በ 24 (TEMPOL-24-αS) እና 122 (TEMPOL-122-αS) ላይ ተዋህደዋል። በቅደም ተከተል.ስፒን መለያ መስጠት ለEPR ሙከራዎች፣ የ αS ትኩረት በ100 μM ተቀምጧል እና የPEG ትኩረት 15% (w/v) ነበር።ለተለያዩ የውህደት ሁኔታዎች፣ αS: pLK ጥምርታ 1:10 ነበር፣ αS:ΔNt-Tau እና αS:Tau441 ሬሾዎች በ1፡1 ተጠብቀዋል።መጨናነቅ በማይኖርበት ጊዜ አስገዳጅ የቲትሬሽን ሙከራዎችን ለማድረግ TEMPOL-122-αS በ 50 μM እና ፖሊኬቲክስ እየጨመረ በሚሄድ ትኩረት ተሰጥቷል, እያንዳንዱን ሁኔታ በተናጠል በማዘጋጀት.የCW-EPR መለኪያዎች የተከናወኑት በ Bruker ELEXSYS E580 X-band spectrometer በመጠቀም ብሩከር ER4118 SPT-N1 ሬዞናተር ያለው በማይክሮዌቭ (SHF) ድግግሞሽ ~9.7 ጊኸ ነው።የሙቀት መጠኑ በ 25 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ እና በፈሳሽ ናይትሮጅን ክሪዮስታት ቁጥጥር ይደረግበታል.ስፔክተራው ባልተሟሉ ሁኔታዎች በ 4 ሜጋ ዋት ኃይል, በ 0.1 ኤም ኤም ሞጁል ስፋት እና በ 100 kHz ድግግሞሽ መጠን ተገኝቷል.Tau441 ወይም ΔNt-Tau (በመጀመሪያው የፕሮቲን መፍትሄዎች ውስጥ ያሉ) ናሙናዎች ውስጥ ባሉ የቅናሽ ወኪሎች ክምችት ምክንያት በናሙናዎች መካከል ያለውን የስፒት ክምችት ልዩነት ለማስወገድ እና የእሽክርክሪት ቅነሳ ልዩነቶችን ለማስወገድ የስፔክተራል ጥንካሬዎች መደበኛ ተደርገዋል።የተሰጡት የ g ዋጋዎች የተገኙት በማትላብ®67 ውስጥ በተተገበረው Easyspin ሶፍትዌር (ቁ. 6.0.0-dev.34) በመጠቀም በተከናወነው የEPR ስፔክትራል ሞዴሊንግ ምክንያት ነው።መረጃውን ለመቅረጽ አንድ/ሁለት አካል isotropic ሞዴሎች ጥቅም ላይ ውለዋል።ሁሉንም ምልክቶች ከተለመዱ በኋላ, ቀሪዎቹ እያንዳንዱን ተምሳሌት ከተዛማጅ የሙከራ ስፔክትረም በመቀነስ ይሰላሉ.አስገዳጅ የቲትሬሽን ትንተና፣ የሦስተኛው ባንድ አንጻራዊ ጥንካሬ ከመደበኛው የ EPR ስፔክትረም (IIII/III) ሁለተኛ ባንድ ጋር የ polycationsን ከ αS ጋር ለመከታተል ጥቅም ላይ ውሏል።የመለያየትን ቋሚ (Kd) ለመገመት የተገኘው ኩርባ n ተመሳሳይ እና ገለልተኛ ማያያዣ ጣቢያዎችን ግምት ውስጥ በማስገባት ወደ ግምታዊ ሞዴል ተጭኗል።
የNMR ስፔክትሮስኮፒ ሙከራዎች የተከናወኑት ብሩከር ኒዮ 800 MHz (1H) NMR spectrometer በመጠቀም ክሪዮፕሮብ እና ዜድ ግራዲየንት በመጠቀም ነው።ሁሉም ሙከራዎች የተከናወኑት 130-207 µM αS እና ተዛማጅ αS/ΔNt-Tau እና pLK አቻዎችን በ10 mM HEPES፣ 100 mM NaCl፣ 10% DO፣ pH 7.4 እና በ15°C ነው።LPSን በNMR ለመቆጣጠር፣ 10% PEG ወደ ቅድመ-የተደባለቁ ናሙናዎች ተጨምሯል።የኬሚካል ለውጥ መዛባት ሴራ (ምስል 1 ለ) አማካኝ 1H እና 15N የኬሚካል ፈረቃዎችን ያሳያል።የ αS 2D1H-15N HSQC ስፔክትራ የተመደበው በቀደመው ምድብ (BMRB ግቤት #25227) ሲሆን የ HNCA፣ HNCO እና CBCAcoNH 3D spectra በመቅዳት እና በመተንተን የተረጋገጠ ነው።13Cα እና 13Cβ ኬሚካላዊ ፈረቃዎች በ ΔNt-Tau ወይም pLK በተገኙበት የተሰላ ሲሆን በሁለተኛ ደረጃ የመዋቅር አዝማሚያዎች ላይ ሊከሰቱ የሚችሉ ለውጦችን ለመለካት ከ αS ኬሚካላዊ ለውጦች በንጹህ የዘፈቀደ ጥቅልል ​​ኮንፎርሜሽን 68 (ተጨማሪ ምስል 5c)።የR1ρ ተመኖች የሚለካው hsqctretf3gpsi ሙከራዎችን በመቅዳት ነው (ከብሩከር ቤተ-መጽሐፍት የተገኘ) በ8፣ 36፣ 76፣ 100፣ 156፣ 250፣ 400 እና 800 ms መዘግየቶች፣ እና ገላጭ ተግባራቶቹ በተለያዩ የከፍተኛ ፍጥነት መዘግየቶች ተስተካክለዋል። R1ρን እና የሙከራውን እርግጠኛ አለመሆንን ለመወሰን ጊዜዎች።
ባለ ሁለት ቀለም ጊዜ-የተፈታ የፍሎረሰንት ማይክሮስኮፒ ሙከራዎች በንግድ ጊዜ በተፈታ MT200 fluorescence confocal microscope (PicoQuant, Berlin, Germany) በጊዜ-ተዛማጅ ነጠላ የፎቶን ቆጠራ (TCSPC) መሳሪያ ላይ ተካሂደዋል።የሌዘር ዳዮድ ጭንቅላት ለ pulsed interleaved excitation (PIE) ጥቅም ላይ ይውላል፣ ጨረሩ በአንድ ሞድ ሞገድ ውስጥ ያልፋል እና ከ 10 እስከ 100 nW ባለው የሌዘር ሃይል ከ 481 nm እና 637 nm የሌዘር መስመሮች ከዲችሮይክ መስታወት በኋላ ይለካሉ።ይህ የፎቶን አሊያሲንግ፣ የፎቶ ማበጠር እና ሙሌት ተጽእኖን በማስወገድ ጥሩውን የፎቶን ቆጠራ መጠን ያረጋግጣል።μ-ስላይድ angiogenesis መሸፈኛዎች ወይም ሳህኖች (Ibidi GmbH, Gräfelfing, ጀርመን) በ Super Apochromat 60x NA 1.2 ሌንስ ላይ የማስተካከያ አንገትጌ (Olympus Life Sciences, Waltham, USA) ላይ በቀጥታ በማጥለቅ ውሃ ውስጥ ተቀምጠዋል.488/640 nm dichroic mirror (Semrock, Lake Forest, IL, USA) እንደ ዋናው የጨረር መከፋፈያ ጥቅም ላይ ውሏል.ያልተነጣጠረ የጨረር ጨረር በ 50 ማይክሮን ዲያሜትር ባለው ቀዳዳ ታግዷል, ከዚያም ያተኮረው ጨረር በ 50/50 ጨረር መሰንጠቂያ ወደ 2 የመለየት መንገዶች ይከፈላል.የባንድፓስ ልቀት ማጣሪያዎች (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 ለአረንጓዴ ቀለም (AF488) እና 690/70 ለቀይ ቀለም (Atto647N) ከጠቋሚው ፊት ለፊት ጥቅም ላይ ውለዋል.ነጠላ-ፎቶ አቫላንቼ ዳዮዶች (SPAD) (ማይክሮ ፎቶን መሣሪያዎች፣ ቦልዛኖ፣ ጣሊያን) እንደ ማወቂያዎች ጥቅም ላይ ውለዋል።ሁለቱም የመረጃ አሰባሰብ እና ትንተና የተከናወኑት በንግድ የሚገኘውን SymphoTime64 ሶፍትዌር (PicoQuant GmbH፣ Berlin፣ Germany) በመጠቀም ነው።
ሃምሳ ማይክሮ ሊትር የኤልኤልፒኤስ ናሙናዎች በμ-Slide angiogenesis ጉድጓዶች (Ibidi GmbH፣ Gräfelfing፣ ጀርመን) ላይ ተተግብረዋል።የተገኙት ምስሎች ከጉድጓዱ በታች 20 µm ላይ ያተኮሩ ናቸው ለተሻለ የስራ ርቀት ለተንጠለጠሉ ጠብታዎች እና ~ 1 µm በራፍቶች እና ነጥቦች ቢያንስ 0.25 μm/ፒክስል የአክሲያል ጥራት እና 400 µs/ፒክስል የመዘግየት ጊዜ።በእያንዳንዱ ቻናል አማካኝ የጀርባ ሲግናል መጠን (PBG፣ አማካኝ + 2σ) ላይ በመመርኮዝ የኃይለኛነት ገደብን በመተግበር መረጃን ይምረጡ ስለዚህ ፈሳሽ ፕሮቲን ጠብታዎች፣ ራፎች ወይም ነጠብጣቦች ብቻ እንዲመረጡ፣ ከተበተነው ምዕራፍ ምንጩን በማጣራት።የእያንዳንዱን ቻናል የእያንዲንደ ዝርያ (τ) የህይወት ዘመንን (አረንጓዴ፣ "ጂ" ለኤኤፍ488 እና ቀይ፣ "r" ለ Atto647N) ለመተንተን፣ ጠብታዎችን፣ ራፎችን ወይም ነጠብጣቦችን የያዙ የፍላጎት ክልሎችን (ROIs) መርጠናል (ተጨማሪ ምስል 1) ).8ለ) እና የህይወት ዘመን መበስበስን (τD፣ τR እና τP ለ droplets፣ rafts or spots፣ በቅደም ተከተል፣ ተጨማሪ ምስል 8 ሐን ይመልከቱ) በእያንዳንዱ ቻናል ላይ ጭራ የሚመጥን ትንተና እና ባለ ሁለት አካል የመበስበስ ሞዴል በመጠቀም ተገኘ።አማካይ τ ከ τ .ለባለ ብዙ ገላጭ ተስማሚ በጣም ጥቂት ፎቶኖች ያመነጩ ROIs ከመተንተን ተገለሉ።ጥቅም ላይ የዋለው መቁረጫ <104 ፎቶን ለራፍት እና ነጥብ እና 103 ለጠብታዎች ነበር።በምስሉ መስክ ላይ ያሉት ጠብታዎች ብዙ ጊዜ ያነሱ እና ያነሱ ስለሆኑ ጠብታዎቹ ከፍ ያለ የኃይለኛነት እሴት ያላቸው የመበስበስ ኩርባዎችን ለማግኘት አስቸጋሪ ስለሆነ ዝቅተኛ ጣራ አላቸው።ከፎቶን ክምችት ገደብ በላይ (ወደ> 500 ቆጠራዎች/ፒክሴል የተቀናበረ) ያላቸው ROI ለመተንተን ተጥለዋል።ከፍላጎት ክልል የተገኘውን የኃይለኛነት መበስበስ ኩርባ ከከፍተኛው 90% (ከከፍተኛው የመበስበስ መጠን ትንሽ በኋላ) ከአገልግሎት ህይወት መጀመሪያ ጀምሮ በማዛመድ ለሁሉም የኃይለኛ መበስበስ ተመሳሳይ ሆኖ እያለ አነስተኛውን የአይአርኤፍ ጣልቃገብነት ያረጋግጡ። ቅንጅቶች አንጻራዊ የጊዜ መስኮት ከ 25 እስከ 50 ROI ለራፍት እና ስፖቶች እና 15-25 ROI ለ drops የተተነተነ ሲሆን ምስሎች ከ 4 በላይ ቅጂዎች የተመረጡ ቢያንስ ከ 3 ነጻ ሙከራዎች የተመዘገቡ ናቸው.ባለ ሁለት ጭራ ቲ-ሙከራዎች በዝርያዎች መካከል ወይም በኮአሰርቫት ሲስተም መካከል ያለውን ስታቲስቲካዊ ልዩነት ለመገምገም ጥቅም ላይ ውለዋል።ለህይወት ዘመን (τ) የፒክሰል-በ ፒክስል ትንተና፣ ለእያንዳንዱ ሰርጥ በእርሻው ላይ ያለው አጠቃላይ የህይወት መዳከም ይሰላል እና የ2/3-አካል ገላጭ አቴንሽን ሞዴል ግምታዊ ስሌት ተካሂዷል።የእያንዳንዱ ፒክሴል የህይወት ዘመን መዳከም ቀደም ሲል የተሰሉ τ እሴቶችን በመጠቀም ተጭኗል፣ ይህም የውሸት ቀለም FLIM ተስማሚ ምስል ተገኘ።ከጅራት ጋር የሚስማማ የህይወት ዘመን በሁሉም ተመሳሳይ ሰርጥ ምስሎች ላይ አንድ አይነት ነበር፣ እና እያንዳንዱ መበስበስ አስተማማኝ ምቹ ሁኔታን ለመስጠት የሚያስችል በቂ ፎቶኖች አፍርቷል።ለ FRET ትንተና ፒክሰሎች የተመረጡት ዝቅተኛ የጥንካሬ መጠን 100 ፎቶን በመተግበር ሲሆን ይህም አማካይ የ11 ፎቶን የጀርባ ምልክት (FBG) ነው።የእያንዳንዱ ቻናል የፍሎረሰንት ጥንካሬ በሙከራ በተወሰኑ የማስተካከያ ሁኔታዎች ተስተካክሏል፡ 69 spectral crosstalk α 0.004 ነበር፣ ቀጥተኛ አበረታች β 0.0305 ነበር፣ የማወቅ ብቃት γ 0.517 ነበር።የ FRET ቅልጥፍና በፒክሰል ደረጃ በሚከተለው ቀመር ይሰላል፡
ኤፍዲዲ በለጋሽ (አረንጓዴ) ቻናል ላይ የሚታየው የፍሎረሰንት መጠን ሲሆን ኤፍዲኤ በተቀባይ (ቀይ) ሰርጥ ላይ በተዘዋዋሪ አነሳሽነት ላይ የሚታየው የፍሎረሰንት መጠን ሲሆን FAA ደግሞ በቀጥታ መነሳሳት በተቀባዩ (ቀይ) ሰርጥ ላይ የሚታየው የፍሎረሰንት መጠን ነው። ፒኢ)።በሰርጡ ውስጥ የፍሎረሰንት ኃይለኛ ምቶች ይታያሉ).
100 µl የኤልኤልፒኤስ ምላሽ መፍትሄዎች 25µM መለያ የሌለው ሞኖሜሪክ ታው441 (ከ25 μM αS ጋር ወይም ያለ 25 μM αS) በኤልኤልፒኤስ ቋት ውስጥ (ከላይ የተጨመረው) በ96-ጉድጓድ ማይክሮፕሌትስ ላይ ተጣባቂ ፎይል ሽፋን እና ነጠብጣብ መፈጠር በWF ማይክሮስኮፒ ከተረጋገጠ በኋላ ያስቀምጡ። ሚዛናዊነት.በ10 ደቂቃ ውስጥበክፍል ሙቀት ውስጥ ከ 48 ሰአታት በኋላ, የፕሮቲን ራፎች እና ነጠብጣቦች መኖራቸው ተረጋግጧል.ከዚያም ፈሳሹን ከጉድጓዶቹ ውስጥ በጥንቃቄ ያስወግዱት, ከዚያም 50 ኤል ዲሴሲየሽን ቋት (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) እና ለ 10 ደቂቃዎች ይጨምሩ.ከፍተኛ የጨው ክምችት LLPS በተቀረው PEG ምክንያት እንደማይደገም ያረጋግጣል፣ እና በኤሌክትሮስታቲክ መስተጋብር ብቻ ሊፈጠሩ የሚችሉ የፕሮቲን ስብስቦች ይበተናሉ።የጉድጓዱ የታችኛው ክፍል በማይክሮፒፔት ጫፍ በጥንቃቄ ተጠርጓል እና የተገኘው መፍትሄ ወደ ባዶ የመመልከቻ ጉድጓድ ተላልፏል.ናሙናዎችን በ 50 μM ThT ለ 1 ሰአታት ከታጠቁ በኋላ, የተለዩ ቦታዎች መኖራቸውን በ WF ማይክሮስኮፕ ታይቷል.300 µl የ70-µM αS መፍትሄ በፒቢኤስ ከፒኤች 7.4፣ ሶዲየም አዚድ 0.01% በ37°C እና 200 ደቂቃ በሰአት በኦርቢትል መንቀጥቀጥ ለ7 ቀናት በማፍለቅ sonicated αS ፋይብሪሎችን ያዘጋጁ።ከዚያም መፍትሄው በ 9600 × g ለ 30 ደቂቃዎች ማእከላዊ ተደረገ, እንክብሉ በፒቢኤስ ፒኤች 7.4 እና በድምፅ (1 ደቂቃ, 50% ዑደት, 80% amplitude in a Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) ፋይብሪል ናሙናዎች ከትንሽ ፋይብሪሎች ጋር በአንጻራዊነት ተመሳሳይ መጠን ያለው ስርጭት.
የ FCS/FCCS ትንተና እና ባለ ሁለት ቀለም የአጋጣሚ ነገር ማወቂያ (TCCD) በተመሳሳይ የ MT200 ጊዜ-የተፈታ የፍሎረሰንት ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ (Pico-Quant, Berlin, Germany) ለ FLIM-FRET ማይክሮስኮፕ ሙከራዎች በፒኢኢ ሁነታ ተጠቅመዋል.የእነዚህ ሙከራዎች የሌዘር ኃይል ወደ 6.0 µW (481 nm) እና 6.2 µW (637 nm) ታክሏል።የእነዚህ የሌዘር ሃይሎች ጥምርነት ለጥቅም ላይ የዋሉት የፍሎሮፎሮች ጥንድ ተመሳሳይ ብሩህነት ለማምረት ተመርጧል ጥሩ የቁጥር መጠኖችን በማሳካት እና የፎቶ ክሊኒንግ እና ሙሌትን በማስወገድ።ሁለቱም የመረጃ አሰባሰብ እና ትንተና የተከናወኑት በንግድ የሚገኘውን SymphoTime64 ስሪት 2.3 ሶፍትዌር (PicoQuant, Berlin, Germany) በመጠቀም ነው።
ኤልኤልፒኤስን በመጠቀም የተገኙ የነጠላ αS/Tau ድምር ናሙናዎች በተናጥል ቋት ውስጥ ወደሚፈለገው የሞኖሞሎኩላር ክምችት (በተለምዶ 1፡500 ዳይሉሽን) ከኮአሰርቫት ናሙናዎች ሲገለሉ ውህዱ በዝቅተኛ ክምችት ላይ ስለሚገኝ።ናሙናዎች በቀጥታ ወደ ሽፋኖች (ኮርኒንግ, ዩኤስኤ) በ BSA መፍትሄ በ 1 mg / ml ክምችት ላይ ተጭነዋል.
በአረንጓዴ እና ቀይ ቻናሎች ውስጥ ላለው የPIE-smFRET ትንተና፣ በሞኖሜሪክ ክስተቶች ምክንያት የሚመጡትን ዝቅተኛ የጥንካሬ ምልክቶችን ለማጣራት ዝቅተኛ የጥንካሬ ገደብ 25 ፎቶን ተተግብሯል (ልብ ይበሉ ሞኖመሮች ከተጠራቀሙ ናሙናዎች በገለልተኛ ድምር ሲነፃፀሩ)።ይህ ገደብ ከንፁህ ሞኖሜር ናሙናዎች ትንተና ከተገኘው የሞኖሜሪክ αS አማካኝ ጥንካሬ በአምስት እጥፍ የሚሰላው በተለይ ለመተንተን አጠቃላይ ድምርን ለመምረጥ ነው።የPIE ድራይቭ ዑደቱ፣ ከTSCPC መረጃ ማግኛ ጋር፣ ዳራ እና ስፔክትራል ንግግሮችን ለማስወገድ የሚያግዝ የህይወት ዘመን የክብደት ማጣሪያን ተግባራዊ ለማድረግ አስችሏል።ከላይ የተጠቀሱትን ገደቦች በመጠቀም የተመረጠው የፍላር ጥንካሬ ከሂስቶግራም ክስተት ሂስቶግራም እና ቋት-ብቻ ናሙናዎች የተወሰነውን አማካኝ የጀርባ ምልክት በመጠቀም ተስተካክሏል።ከትልቅ ድምር ጋር የተያያዙ ፍንዳታዎች በጊዜ ፍለጋው ውስጥ ብዙ ተከታታይ ማጠራቀሚያዎችን ይይዛሉ (ወደ 1 ሚሴ ተቀናብሯል)።በእነዚህ አጋጣሚዎች ከፍተኛ ጥንካሬ ያለው ቢን ተመርጧል.ለ FRET እና stoichiometric ትንተና፣ በንድፈ-ሀሳብ የሚወሰነው ጋማ ፋክተር γ (0.517) ጥቅም ላይ ውሏል።ስፔክተራል ክሮስቶክ እና ቀጥተኛ አበረታች አስተዋፅዖዎች በጥቅም ላይ በሚውለው የማነቃቂያ ሌዘር ሃይል ቸል አይሉም (በሙከራ ተወስነዋል)።በፍንዳታ ውስጥ የ FRET ቅልጥፍና እና ስቶቲዮሜትሪ እንደሚከተለው ይሰላል።