310 10*1ሚሜ አይዝጌ ብረት የተጠቀለለ ቱቦ ኬሚካላዊ ክፍል ፣የኤን-ተርሚናል የ spidroin ጎራዎች በአሚሎይድ ፋይብሪል ላይ የተመሰረቱ ሀይድሮጅሎችን ይመሰርታሉ እና ፕሮቲን እንዳይነቃነቅ መድረክ ይሰጣሉ።

Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ ያለው የአሳሽ ስሪት እየተጠቀሙ ነው።ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)።በተጨማሪም, ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ, ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን.
በእያንዳንዱ ስላይድ ሶስት መጣጥፎችን የሚያሳዩ ተንሸራታቾች።በተንሸራታቾች ውስጥ ለመንቀሳቀስ የኋላ እና ቀጣይ ቁልፎችን ይጠቀሙ ፣ ወይም በእያንዳንዱ ስላይድ ውስጥ ለመንቀሳቀስ በመጨረሻው ላይ ያሉትን የስላይድ መቆጣጠሪያ ቁልፎችን ይጠቀሙ።

ዝርዝር መግለጫ

310 10*1 ሚሜ አይዝጌ ብረት የተጠቀለለ ቱቦ አቅራቢዎች

የኬሚካል ቅንብር

ሜካኒካል ንብረቶች

Recombinant የሸረሪት ሐር ፕሮቲኖች (የሸረሪት ሐር ፕሮቲኖች) አዳዲስ ባዮሜትሪዎችን ለማዳበር ብዙ እምቅ አፕሊኬሽኖች አሏቸው፣ ነገር ግን መልቲሞዳል እና ውህድ-ተጋላጭ ባህሪያቸው በቀላሉ ለማግኘት እና ለመጠቀም ቀላል ያደርጋቸዋል።እዚህ ላይ ሪኮምቢንታንት ድንክዬ ስፓይድሮይን ፕሮቲኖች እና፣ በአስፈላጊነቱ፣ N-terminal domain (NT) ራሱ በፍጥነት በ37 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ እራሳቸውን የሚደግፉ እና ግልጽ ሃይድሮጅሎችን ይፈጥራሉ።የ NT እና አረንጓዴ ፍሎረሰንት ፕሮቲን ወይም ፑሪን ኑክሊዮሳይድ ፎስፈረስላይዝ ያካተቱ የውህድ ፕሮቲኖች ሙሉ ለሙሉ የሚሰሩ የውህደት ፕሮቲኖችን ይመሰርታሉ።Hydrogels.ውጤታችን እንደሚያሳየው ዳግም የተዋሃዱ ኤንቲ እና ውህድ ፕሮቲኖች ከፍተኛ የገለፃ ምርትን ይሰጣሉ እና ሀይድሮጀሎችን እንደ ግልፅነት ፣ ያለ ማቋረጫ እና ቀጥታ ንቁ ፕሮቲኖችን በከፍተኛ ጥግግት ያሉ ማራኪ ባህሪያትን ይሰጣሉ።
ሸረሪቶች እስከ ሰባት የሚደርሱ የተለያዩ የሐር እጢዎች አሏቸው፣ እያንዳንዳቸው አንድ ዓይነት የሐር ዓይነት ያመርታሉ።ሰባቱም የሐር ዝርያዎች ከሸረሪት ሐር ፕሮቲኖች (ስፒድሮኖች) በግምት ወደ 6000 የሚጠጉ ቅሪቶች ያቀፈ ሲሆን ትልቅ ማዕከላዊ መድገም ክልል በሉላዊ N- እና C-terminal domains (NT and CT) የተከበበ ነው (ኤንቲ እና ሲቲ)1፣2።በሰፊው ጥናት የተደረገበት የሐር ዓይነት፣ ቀዳሚ አምፑላ የሚመረተው በቀዳማዊ አምፑላ እጢ ነው።በዚህ እጢ ውስጥ አንድ ሞኖላይየር የኤፒተልየል ሴሎች የ spidroin ፕሮቲኖችን ያዋህዳል እና ወደ እጢው ሉሚን ያመነጫል ፣ እዚያም በሚሟሟ ቅርፅ (ዶፒንግ) እጅግ በጣም ከፍተኛ መጠን (30-50% w/v) 3,4።በ gland ውስጥ ዋና የአምፑላር ስፓይድሮይን ፕሮቲኖች አደረጃጀት እና መመሳሰል ተከራክሯል፣ ነገር ግን አብዛኛዎቹ የሙከራ ማስረጃዎች በአጠቃላይ ሄሊካል እና/ወይም የዘፈቀደ ሄሊካል ኮንፎርሜሽን እና ማይክል ወይም ላሜላር መዋቅሮች 5,6,7,8,9,10 መኖሩን ያመለክታሉ.ተደጋጋሚው ጎራዎች የሐር ፋይበር መካኒካል ባህሪያትን ሲቆጣጠሩ፣ β-sheet nanocrystals እና amorphous structures11,12,13,14,15, የመጨረሻ ጎራዎች ከሐር እጢ ጋር ለተለዋዋጭ ሁኔታዎች ምላሽ ለመስጠት የሐር ፋይበርን ይቆጣጠራሉ16,17,18.የሐር አሠራርን በመቆጣጠር፣ 19. የተርሚናል ጎራዎች በዝግመተ ለውጥ የተጠበቁ ናቸው እና ተግባራቸው ለሁሉም የ spidroin ፕሮቲኖች የተለመደ ሊሆን ይችላል 2,20,21.በ gland ውስጥ በሚያልፉበት ጊዜ የ spidroin ፒኤች ከ 7.6 ወደ <5.716 ይቀንሳል እና በመላጨት እና በመለጠጥ ቀስ በቀስ እየጠበበ ባለው ቱቦ ውስጥ በመንቀሳቀስ መካከለኛ ይጨምራል.በመፍትሔው ውስጥ፣ ሲቲ የ α-helical connstitutive parallel dimer17 ነው፣ ነገር ግን ለዝቅተኛ ፒኤች እና ሸለተ ሃይሎች ምላሽ፣ ሲቲ ይገለጣል እና β-layers16, 17 ይቀይራል፣ ምናልባትም በ Convert 16 ተደጋጋሚ ክልሎች ውስጥ β-ንብርብሮችን ያስነሳል። NT monomeric በታች ናቸው። ሁኔታዎች በጨጓራ እጢ ውስጥ ያሉ ሁኔታዎችን የሚያንፀባርቁ እና የ spidroinን መሟሟት ያስተካክላሉ ፣ ግን በተቀነሰ ፒኤች ፣ በርካታ የካርቦቢሊክ አሲድ የጎን ሰንሰለቶች ፕሮቶኔሽን ወደ NT በግምት 6.5 ፒካ ወደ 6.5 ያመራል ፣ በዚህም NT ን ያረጋጋል እና spidroinን በትልቅ መጠን ያስተካክላል። መጠኖች.አውታረ መረቦች16,18.ስለዚህ፣ NT በፋይበር አፈጣጠር ውስጥ ቁልፍ ሚና የሚጫወተው፣ በሽፋኑ ውስጥ ካለው ሞኖመር ወደ ፋይበር23፣24፣25 ዲመር በመቀየር ነው።NT እስከ 16 ፣ 18 ፣ 19 ፣ 20 ፣ 26 ፣ 27 ፣ 28 ፣ ​​29 ድረስ በተጠናው በሁሉም ሁኔታዎች ውስጥ በጣም የሚሟሟ እና ሄሊካል ሆኖ ይቆያል ፣ ይህም እድገቱን እንደ ሄትሮሎጂካል ፕሮቲኖች ለማምረት የመሟሟት አበረታች መለያ ነው።
Recombinant ሚኒ ሸረሪት ሐር ፕሮቲን፣ አንድ NT፣ አንድ አጭር መድገም ክልል፣ አንድ ሲቲ እና His6 መለያ (His-NT2RepCT) ለመንጻት እንደ ቤተኛ የሸረሪት ሐር ፕሮቲን በውሃ ቋት ውስጥ የሚሟሟ እና የሐር ሸረሪት ቤተኛ ጠቃሚ ባህሪያትን ያስመስላል። .ሽፋን 25.31.His-NT2RepCT ፒኤች 8 የሚሟሟ ሽፋን ወደ ፒኤች 525,32,33,34,35 የውሃ መታጠቢያ ውስጥ በሚወጣበት ባዮሚሜቲክ ማሽን በመጠቀም ቀጣይነት ባለው ፋይበር ውስጥ ሊሽከረከር ይችላል።ሂሱን-NT2RepCT የሚገልጽ የኢ.ኮላይ ባዮሬክተር ፍላት እና በኋላ የተደረገው ህክምና ከተጣራ በኋላ>14 g/L ምርትን አስገኝቷል።የ His-NT2RepCT ለአሲዳማ ሁኔታዎች ያለው ከፍተኛ ምርት፣ ከፍተኛ የመሟሟት እና በቂ ምላሽ ሁሉም በNT23፣ 25, 34 ይወሰዳሉ።
እዚህ ላይ የፕሮቲን መፍትሄን በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ በማፍለቅ ኤንቲን ብቻ ጨምሮ ከ recombinant spidroin ፕሮቲኖች ፈጣን የሆነ ግልጽነት ያለው ሃይድሮጅል መፈጠሩን እንገልፃለን።ቲዮፍላቪን ቲ ፍሎረሰንስ (ThT) በመጠቀም ፉሪየር ኢንፍራሬድ ስፔክትሮስኮፒ (FTIR)፣ ኑክሌር ማግኔቲክ ሬዞናንስ ስፔክትሮስኮፒ (NMR) እና ማስተላለፊያ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒ (TEM) በመጠቀም፣ ኤንቲ እና ማይክሮስፓይደር ፕሮቲኖች መዋቅራዊ ለውጥ ወደ β-ሉሆች እና እንደ አሚሎይድ መሰል ፋይብሪሎች ተለውጠዋል። ጄልሎች ሲፈጠሩ.በተጨማሪም የኤንቲ እና የአረንጓዴ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (ጂኤፍፒ) ወይም የፕዩሪን ኑክሊዮሳይድ ፎስፈረስላይዝ (PNP) ውህደት ፕሮቲኖች ሙሉ በሙሉ የሚሰሩ የውህደት ቁርጥራጮች ያሉት ሃይድሮጅልስ ይፈጥራሉ።በሄትሮሎጅስ አስተናጋጆች ውስጥ ከፍተኛ-ግኝት አገላለጽ ፣ በፊዚዮሎጂ ሁኔታዎች ውስጥ የሃይድሮጅል ፈጣን ምስረታ ጋር ተዳምሮ ፣በመሐንዲስ ተግባራት ሃይድሮጅል ወጪ ቆጣቢ የማምረት እድልን ይከፍታል።
ከአብዛኞቹ ሪኮምቢናንት spidroin ፕሮቲኖች 36 በተለየ፣ His-NT2RepCT በTris-HCl ቋት በ pH 8 የተረጋጋ እና እስከ 500 mg/ml ያለ ዝናብ25 ሊከማች ይችላል።ስለዚህ, ይህ ፕሮቲን በፍጥነት በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ (ምስል 1 ለ-ዲ) ውስጥ በሚፈጠርበት ጊዜ በኦፕቲካል ግልጽ እና እራሳቸውን የሚደግፉ ሃይድሮጅሎችን እንደሚፈጥር ስናውቅ አስገርሞናል.ተጨማሪ ጥናቶች እንደሚያሳዩት His-NT2RepCT ጄልሽን በተለያዩ የፕሮቲን ውህዶች (10-300 mg / mL) ላይ የተከሰተ ሲሆን ይህ ትኩረት ከግላጅ ጊዜ ጋር የተገላቢጦሽ ነው (ምስል 1 ሐ እና ተጨማሪ ምስል 1)።የትኛዎቹ የ His-NT2RepCT የሀይድሮጄል አፈጣጠርን እንደሚያስተናግዱ ለማወቅ እያንዳንዱን ጎራ በተናጥል እና በተለያዩ ውህዶች የፍላስክ ግልብጥ ሙከራን በመጠቀም እንመረምራለን (ምስል 1 ሀ፣ ለ)።ሁሉም የተፈተኑ የ recombinant spidroin ክፍልፋዮች ጄል (በፕሮቲን 300 mg/mL) ከ1 ሰአታት ባነሰ ጊዜ ውስጥ ተፈጥረዋል፣ ከተያዘው 2Rep (ምስል 1 ለ) በስተቀር።ይህ የሚያመለክተው ኤንቲ እና ሲቲ ብቻ በጥምረት ወይም ከድግግሞሽ ጋር የተቆራኙት በ37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ላይ ሊገኙ እንደሚችሉ እና የሂስ6 መለያው ይህን ሂደት በምንም መልኩ አይነካውም።ኤንቲ በጣም የሚሟሟ እና የተረጋጋ ፕሮቲን ነው ከሚለው የተለመደ አስተሳሰብ እና ከዚህ ቀደም ስለ recombinant spidroin hydrogels ሪፖርቶች የጌልቴሽን ተጽእኖዎች በተደጋጋሚ ክልሎች እና/ወይም ሲቲዎች ውስጥ የተስተካከሉ ለውጦችን አድርገዋል በማለት፣ ኤንቲ ራሱ ይችላል።የጌልሽን ግኝት ያልተጠበቀ ነበር.ተጨማሪ ሠንጠረዥ 1) 37, 38, 39. በሚያስደንቅ ሁኔታ, ኤን.ቲ. በ 10 ደቂቃ ውስጥ በ≥ 300 mg/mL ክምችት (ምስል 1 ሐ) ውስጥ ተሞልቷል.ከተለያዩ የኤን.ቲ. ክምችት ጋር የተገላቢጦሽ ሙከራዎች እንደሚያሳዩት በ>50 mg/mL የኤን.ቲ. መፍትሄ ከ His-NT2RepCT በተዛማጅ ትኩረት (w/v፣ ምስል 1c) ፈጠነ።
በዚህ ሥራ ውስጥ የተጠኑ የተለያዩ የ spidroin ግንባታዎች ንድፍ ውክልና.b ጄል ጊዜ በ 37 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ለተለያዩ ድጋሚ-መዋሃድ spidroin ፕሮቲኖች (300 mg/mL) ጠርሙሱን በመገልበጥ የተረጋገጠ ነው።ሲቲ ጄል ወዲያውኑ ያለ ማቀፊያ (<300 mg / ml), 2Rep precipitates (300 mg / ml, 5 mm scale).c ጄል ጊዜ የ His-NT2RepCT እና NT በተጠቀሱት የፕሮቲን ውህዶች በ 37 ° ሴ.d የ His-NT2RepCT እና NT hydrogels ፎቶግራፎች ከሸረሪት ጋር እና "NT" የሚል ፊደል ከስር ታትሟል (ሁለቱም 200 mg/mL፣ ሚዛን ባር 5 ሚሜ)።
በተለያዩ ሪኮምቢንታንት ስፓይድሮይን ፕሮቲኖች የተፈጠሩት ሃይድሮጂሎች ትንሽ የተለያየ ቀለም አላቸው፣ እና እርቃናቸውን የዓይን ምልከታ የሚያሳየው የተለያየ ደረጃ ያለው ግልጽነት ነው (ምስል 1 ለ)።ኤንቲ ጄል በተለየ መልኩ ግልጽ ሲሆኑ ሌሎች ጄሎች ደግሞ ግልጽ ይሆናሉ።His-NT2RepCT እና NT gels ወደ ሲሊንደሪካል ቱቦዎች የሚጣሉት ከሻጋታው ሊወገዱ ይችላሉ (ምስል 1d)።
የተፈጥሮ ሸረሪት የሐር ሽፋን ጄል አሁን የ recombinant spidroin ፕሮቲኖች ጄል እንዲፈጠር ምክንያት በተገኘበት ሁኔታ ለመፈተሽ, ሽፋኖች የተሰበሰበው ከስዊድን ድልድይ ሸረሪት (Larinioides slopetarius) ትልቅ የአምፑላ እጢ ነው.ሽፋኖች በ 20 mM Tris-HCl ቋት ውስጥ በ 50 mg/mL (በተለካው ደረቅ ክብደት ላይ ተመስርተው) ተከማችተዋል ነገር ግን በ 21 ቀናት ውስጥ በ 37 ዲግሪ ሴንቲግሬድ (ተጨማሪ ምስል 2 ሀ) ውስጥ ምንም አይነት ጄልሽን አልታየም.
እነዚህን ጂልሶች ለመለካት, የሬኦሎጂካል መለኪያዎች የጂልጂን ሂደትን ለማጥናት እና አጠቃላይ የሜካኒካል ባህሪያትን ለመወሰን ጥቅም ላይ ሊውሉ ይችላሉ.በተለይም የማጠራቀሚያ ሞጁል (መለጠጥ) ከፍ ባለ የሙቀት መጠን መከታተል ስለ ጄሊንግ ሙቀት መጠን እንዲሁም የሽፋኑ የቪስኮላስቲክ ባህሪያት መረጃን ሊሰጥ ይችላል.የሙቀት መጨመር ሙከራዎች (በ 1 ° ሴ / ደቂቃ በ 25-45 ° ሴ በመጠቀም ፣ ከዚህ ቀደም በተደረጉ ጥናቶች የተፈጥሮ የሐር ክምችት መፍትሄዎችን በመጠቀም) 40,41 እንደሚያሳየው የ His-NT2RepCT እና NT መፍትሄዎች የማከማቻ ሞጁሎች የሙቀት መጠኑ እየጨመረ ሄደ።ጨምሯል (ምስል 2 እና ተጨማሪ ምስል 3).በተለይም፣ የኤን.ቲ ሞጁል ከHis-NT2RepCT ጋር ሲነፃፀር በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ማደግ ጀምሯል፣ ይህም NT በቀጥታ በ His-NT2RepCT በ 37°C (ምስል 1) ሲታከል ከታየው ፈጣን ጄል ጊዜ ጋር በማጣመር ነው።የሙቀት መጠኑ ከቀነሰ በኋላ የማጠራቀሚያው ሞጁል ወደ ዝቅተኛ እሴቶች አልተመለሰም እና ከኪሳራ ሞጁሎች በላይ ቆየ (ተጨማሪ ምስል 3ን ይመልከቱ) ይህም በሙቀት የማይለወጥ የተረጋጋ ጄልሽን ያሳያል።ከጄልቴሽን በኋላ የመጨረሻው የመለጠጥ ሞጁል ከ 15 እስከ 330 ኪ.ፒ.ኤ ለ His-NT2RepCT hydrogels በ 100-500 mg / ml, እና የመጨረሻው የመለጠጥ ሞጁል ለ NT hydrogels (100-500 mg / ml) ከ 2 እስከ 1400 ይደርሳል. kPa (ምስል፣ 2 እና የተሟላ የራምፕ መረጃ) ተጨማሪ ምስል 3 ይመልከቱ)።
የ His-NT2RepCT (300 mg/mL) እና b NT (300 mg/mL) በመንቀጥቀጥ በሚለካበት ጊዜ የሙቀት ለውጥ።ቀስቶቹ የሙቀት መጠኑን ያመለክታሉ ፣ እና የማከማቻ ሞጁል መረጃ ቀለል ያለ ጥላ በአምራቹ ከተገለፀው በላይ ለመሣሪያው ዝቅተኛ የማሽከርከር እሴቶችን ያሳያል ፣ ይህም ለድምጽ መጨመር መንስኤ ነው።ከፍ ካለ የሙቀት መጠን (100፣ 300 እና 500 mg/mL) በኋላ የ His-NT2RepCT እና NT የመጨረሻ-ሞዱል ክምችት።ሁሉም የሞዱል ንባቦች በ 0.1 Hz ድግግሞሽ ይወሰዳሉ.
ከጄልሽን ጋር የተዛመዱ የተስተካከሉ ለውጦችን ለመመርመር እንደ እምቅ ዘዴ፣ የ FTIR spectra His-NT2RepCT እና NT በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ በፊት እና በኋላ መዝግበናል (ምስል 3a,b)።እንደተጠበቀው፣ የ His-NT2RepCT እና NT መፍትሄዎች እይታ α-helix/random coil ሁለተኛ ደረጃ መዋቅርን ከሚያሳዩ ፕሮቲኖች ጋር ይዛመዳል፣ በ1645 ሴ.ሜ-1 የሚጠራ ባንድ።ለሁለቱም ሃይድሮጅል, ጄልቴሽን በ 1617 ሴ.ሜ-1 እና 1695 ሴ.ሜ -1 (ምስል 3 ሀ, ለ) መካከል በመካከለኛው I ባንድ ውስጥ ሁለት ክንዶች እንዲፈጠሩ ምክንያት ሆኗል (ምስል 3 ሀ, ለ) ይህም የፀረ-ተመጣጣኝ β-ሉህ አወቃቀሮችን መፈጠሩን ያመለክታል.እነዚህ ለውጦች ደግሞ በሚመለከታቸው ሁለተኛ ተዋጽኦ እና ልዩነት gelation spectra (ተጨማሪ ምስል 4 ለ) ላይ በግልጽ ሊታይ ይችላል.የ NT β-layer ሁለቱ ባንዶች ከ His-NT2RepCT የበለጠ ጎልተው ይታዩ ነበር፣ይህም የሚያሳየው የ β-layer bands በ NT hydrogel ውስጥ ያለው አጠቃላይ ይዘት ከNT2RepCT hydrogel የበለጠ ነበር።
የ FTIR መምጠጥ የ His-NT2RepCT እና b NT (ሁለቱም 500 mg/mL) በፊት (መፍትሄ) እና (ጄል) በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ከመታቀፉ በፊት።ሐ TEM እንደገና የታገዱ 50 mg/ml NT2RepCT gels እና d NT ምስሎች።የመጠን ባር 200 nm.ሠ የ His-NT2RepCT እና NT hydrogels ፋይበር ዲያሜትሮች።n = 100 የሚለካ ፋይብሪሎች, p <0.0001.የስህተት አሞሌዎች መደበኛ መዛባት ያሳያሉ።የስህተት አሞሌዎች መሃል አማካኝ ነው።ለስታቲስቲካዊ ትንተና ያልተጣመረ ቲ-ሙከራ (ሁለት-ጭራ) ጥቅም ላይ ውሏል።ኤፍ ቲ ቲ ፍሎረሰንት የተለያዩ ድጋሚ የስፖንሰር ፕሮቲኖች (100 mg/mL) በ 37 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ሳይንቀጠቀጡ።g NT (100 mg/mL) የክትባት ሙከራዎች ከ100 mg/ml NT gel ከ 0%፣ 5%፣ 10% እና 20% ዘሮች ጋር።
ማስተላለፊያ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ (TEM) በመጠቀም የጄል ትንተና እንደሚያሳየው ሃይድሮጅል አሚሎይድ የሚመስሉ ፋይብሪሎች (ምስል 3c, 3d) ያካትታል.NT-የተሠሩት ፋይብሪሎች ረዘሙ (በዲያሜትር 5-12 nm) እና ቅርንጫፎ የሌላቸው ሲሆኑ የ His-NT2RepCT ፋይብሪሎች ርዝመታቸው አጭር እና በዲያሜትር (7-16 nm) (ምስል 3e) በጣም ሰፊ ነው።እነዚህ ውጤቶች የቲዮፍላቪን ቲ (ThT) ምርመራን በመጠቀም የፋይብሮሲስን ኪነቲክስ እንድንከተል አስችሎናል.ለ recombinant spidroin ፕሮቲኖች ሁሉ፣ ናሙናዎች በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ሲጨመሩ የፍሎረሰንት ምልክት ጨምሯል (ምስል 3f ፣ ተጨማሪ ምስል 5 ሀ)።ከዚህ ግኝት ጋር በሚስማማ መልኩ የ NT እና His-NT2RepCT በአጉሊ መነጽር ሲታይ በጂሊንግ ሁኔታዎች ውስጥ ያለ የ ThT ፍሎረሰንስ አንድ ወጥ የሆነ የ ThT-positive aggregates ክምችት ሳይኖር ታይቷል (ተጨማሪ ምስል 5b,c)።የThT-positive fibrils ምስረታ ከኤንቲ እና የ His-NTCT ትርምስ መጨመር ጋር አብሮ አልመጣም (ተጨማሪ ምስል 5d) ይህ ማለት ጄል ውስጥ ያለው የፋይብሪል ኔትወርክ ጄል ግልጽነትን ሳይጎዳ ሊፈጠር ይችላል።ቀድሞ የተሰሩ ፋይብሪሎች በትንሽ መጠን በመጨመር መዝራት የአንዳንድ አሚሎይድ ፋይብሪል መፈጠርን በከፍተኛ ሁኔታ ያፋጥናል ነገር ግን 5% ፣ 10% ወይም 20% (w/w) NT ወደ NT hydrocoagulants መፍትሄ መጨመር።የዘር ውጤት (ምስል 3 ግ).ምናልባትም ይህ በሃይድሮጅል ውስጥ የሚገኙት ፋይብሪሎች በአንጻራዊነት የተስተካከሉ እና እንደ ዘር ጥቅም ላይ የማይውሉ በመሆናቸው ነው.
በከፍተኛ ሙቀት ውስጥ የሪኮምቢንታንት ስፓይድሮይን ፕሮቲኖች ያልተጠበቀ ባህሪ ተጨማሪ የኒውክሌር ማግኔቲክ ሬዞናንስ (NMR) ስፔክትሮስኮፒ ጥናቶች ጄል ምስረታ ጋር ተያይዘው የሚመጡ ለውጦችን ለመለየት አነሳስቷል።የNMR ስፔክትራ የ His-NT2RepCT መፍትሄዎች በጊዜ ሂደት በ 37°C የተመዘገቡት ሲቲ አሁንም በከፊል የታጠፈ ሲሆን የ NT እና 2Rep ምልክቶች ግን ጠፍተዋል (ምስል 4a) ይህም በዋናነት NT እና 2Rep የሂስ መፈጠርን በከፊል የተቆጣጠሩት መሆኑን ይጠቁማል። NT2RepCT hydrogel.የሲቲ ሲግናሉ ከመጀመሪያው ጥንካሬው ወደ 20% እንዲቀንስ ተደርጓል፣ ይህም ሲቲ በአብዛኛው ቋሚ እና በሃይድሮጅል መዋቅር ውስጥ እንደሚካተት ይጠቁማል።ለትንንሽ የሲቲ ክፍል፣ ልክ እንደ ቅድመ-የተዳቀለው ናሙና ተንቀሳቃሽ እና በመፍትሔ NMR ፣ spectra ለመጀመሪያዎቹ 10 የተዋቀሩ ቀሪዎች ምልክቶች ይጎድላቸዋል ፣ ምናልባትም የተያያዘውን የ His-NT2Rep ክፍልን ለመንቀሳቀስ አስቸጋሪ ስለሆነ።የ NMR spectra of the -state of hydrogels -NT2RepCT የ α-helices እና β-ንብርብሮች ዋነኛ መገኘት እና በመጠኑም ቢሆን የዘፈቀደ ጥቅልል ​​ኮንፎርሜሽን (ምስል 4b) አሳይቷል።በአኪ ውስጥ ብቻ የሚገኙት የሜቲዮኒን ቅሪቶች የኬሚካል ለውጥ ትንተና እንደሚያሳየው ይህ ጎራ ወደ β-ሉህ መዋቅር መቀየሩን ያሳያል።በመፍትሔው ውስጥ ያለው የጊዜ-ጥገኛ የ NT ምልከታ አንድ ወጥ የሆነ የሲግናል መጠን መቀነስ አሳይቷል (ምስል 4 ሐ) እና ጠንካራ-ግዛት NMR የ NT hydrogels አብዛኛዎቹ የ NT ቅሪቶች ወደ β-ሉህ መዋቅሮች ተለውጠዋል (ምስል 4d) አሳይቷል።የመደመር ዝንባሌ ስላለው የ 2Rep ውህደቱ ተለይቶ ሊታወቅ አልቻለም።ነገር ግን፣ የ NTCT እና His-NT2RepCT hydrogels የጠንካራ ሁኔታ NMR ስፔክትራ በጣም ተመሳሳይ ይመስላሉ (ምስል 4 ለ፣ ተጨማሪ ምስል 6 ለ)፣ ይህም 2Rep ለ His-NT2RepCT hydrogel መዋቅራዊ አካል ትንሽ አስተዋፅኦ እንዳበረከተ ይጠቁማል።ለ CT hydrogels, α-helices, β-sheets እና የዘፈቀደ ሄሊካል ሁለተኛ ደረጃ መዋቅሮች መኖራቸውን (ተጨማሪ ምስል 6 መ) ተገኝተዋል.ይህ የሚያሳየው አንዳንድ የሲቲ ክፍሎች α-helices ሲቀሩ ሌሎቹ ደግሞ β-ሉሆች ይሆናሉ።ስለዚህ፣ የኤንኤምአር ስፔክትሮስኮፒ ውጤቶች ኤንቲ ለሀይድሮጄል ምስረታ አስፈላጊ እንደሆነ እና እንዲሁም ከ 2Rep እና CT ጋር ሲዋሃዱ ወደ β-sheet conformation እንደሚቀየር ይጠቁማሉ።ከዚህ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ በቅርብ ጊዜ አሚሎይድ ስፓሻል ዚፐሮች በ NT ጎራ ውስጥ በአምስቱም ሄሊሶች ውስጥ ሊፈጠሩ እንደሚችሉ ደርሰንበታል፣ እና የዋልትዝ ስልተ ቀመር በሄሊክስ 1 (ምስል 4e) ውስጥ አሚሎይዶጅኒክ ክልል እንዳለ ተንብዮአል።
2D spectra 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT መፍትሄ ከ (ሰማያዊ) በፊት እና ከ19 ሰአታት በኋላ (ቀይ) በ37°ሴ።በቀይ ስፔክትረም ውስጥ ያሉ የግለሰብ የመስቀል ጫፎች እና F24, G136, ፖሊኤ በሰማያዊ ስፔክትረም በአንድ ፊደል በአሚኖ አሲድ ምልክቶች እና በቀሪ ቁጥሮች ይገለጻሉ.ውስጠቶቹ ከ NT፣ 2Rep እና CT ጎራዎች ለተመረጡት ቀሪዎች የምልክት ጥንካሬ በጊዜ ላይ ጥገኛ መሆኑን ያሳያሉ።ለ የ His-NT2RepCT hydrogels የ Solid-state radiofrequency (RFDR) spectra።በ RFDR spectra ውስጥ የተስተዋሉ የ Cα/Cβ ቅሪቶች ተዛማችነት የሚወሰነው ከሞዴል peptide ኬሚካላዊ ለውጦች እና ከስታቲስቲክስ 82,83 እና ከሁለተኛ ደረጃ መዋቅሮቻቸው የተገኙ እሴቶች ጋር በማነፃፀር ነው።SSB - የሚሽከረከር የጎን ባንድ.ሐ ባለ አንድ-ልኬት የ 15N-HSQC 10 mg/mL NT መፍትሄ በ 37 ° ሴ ለ 36 ሰአታት.ውስጠቱ በጊዜ አንፃር የድምፅ መጠን ያሳያል።d ጠንካራ ሁኔታ RFDR የ NT hydrogels እይታ።በ RFDR spectra ውስጥ የተስተዋሉ የ Cα/Cβ ቅሪቶች እና የሁለተኛ ደረጃ መዋቅሮቻቸው ትስስሮች ተጠቁመዋል።ሠ ከዚፕር ዳታቤዝ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) በ NT45.79 ፋይብሪሌሽን ዝንባሌ መገለጫ ላይ የተመሠረተ።የሄክሳፔፕታይድ የቦታ መብረቅ ፈረቃ መስኮት የሮሴታ ኢነርጂ በ kcal/mol ውስጥ ይታያል።ቀይ አሞሌዎች ሄክሳፔፕቲዶችን ያመለክታሉ ከፍ ያለ የፋይብሮሲስ ዝንባሌ (የሮሴታ ኃይል ከ -23 kcal / ሞል በታች ፣ ከነጥብ መስመር በታች)።አረንጓዴ አሞሌዎች የሮዝታ ሃይሎች ከጣራው በላይ ያሉ ቁርጥራጮችን ያመለክታሉ እና ስለዚህ ስቴሪክ ዚፕ የመፍጠር ዕድላቸው አነስተኛ ነው።ፕሮሊን የያዙ ቁርጥራጮች ከመተንተን (ያለ ዓምዶች) ተወስደዋል.ካሬዎች በዋልት ስልተ ቀመር81 (https://waltz.switchlab.org) የተተነበዩ የአሚሎይዶሲስ አካባቢዎችን ያመለክታሉ።የ NT የአሚኖ አሲድ ቅሪቶች ቅደም ተከተል ከላይ ነው, እና በ β ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ውስጥ የሚገኙት ቅሪቶች ዓይነቶች (በጠንካራ-ግዛት NMR spectroscopy ይወሰናል) በቀይ ይታያሉ.የአምስቱ NT α-helices አቀማመጥ እንደ (H1-H5)28 ተወስኗል።
በፒኤች <6.5፣ ኤች ቲ ዲሜራይዝድ ያደርጋል፣ በሙቀት-ወይም በዩሪያ-የሚፈጠር denaturation18።የኤን.ቲ ዲሜራይዜሽን እና መረጋጋት ጄልሽን እንዴት እንደሚጎዳ ለማብራራት፣ 100 mg/ml NT የያዙ መፍትሄዎች በፒኤች 8፣ 7 እና 6 የVal inversion test ተቆጣጠሩ።የኤንቲ ናሙናዎች በፒኤች 8 እና በ 7 ከ30 ደቂቃ በኋላ በ37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ተሞልተው ነበር፣ ነገር ግን ፒኤች 8 ጄል ግልጽ ሆኖ ቆይቷል፣ ፒኤች 7 ጄል ደግሞ የሚታይ ዝናብ ያሳያል (ምስል 5 ሀ)።በአንጻሩ ኤችቲ በ pH 6 ያለው መፍትሄ ጄል አልፈጠረም እና ትልቅ ዝናብ ከ 20 ደቂቃ በኋላ በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ሊታይ ይችላል.ይህ የሚያሳየው ከሞኖመሮች ጋር ሲነፃፀሩ እራሳቸውን እና/ወይም ከፍተኛ መረጋጋትን የሚቀንሱት ጄልሽንን ይከላከላል።ኤንቲ በ 200 mg/ml27 የሚሟሟ እና በቀላሉ ከሙቀት መጠን በኋላ የሚገለበጥ እና እንዲሁም α-ሄሊክስን በዝቅተኛ ዋጋ ይይዛል ተብሎ ስለተዘገበ ለ NT በ pH 7 እና 6 የዝናብ መፈጠር አልተጠበቀም። pH 18. ለእነዚህ አለመግባባቶች ሊገለጽ የሚችል ማብራሪያ ቀደም ሲል ሪፖርት የተደረጉ ሙከራዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ ወይም ከዚያ በታች ወይም በአንጻራዊነት ዝቅተኛ የፕሮቲን ውህዶች16,18,19.
በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ከገባ በኋላ የኤን.ቲ.b NT CD spectra ከ 154 mM NaF እና 154 mM NaCl ጋር እና ያለ።በ 222 nm ላይ ያለው ሞላር ኤሊፕቲክ ወደ ተፈጥሯዊ እጥፋቶች መጠን ይለወጣል.ሐ NT የተገላቢጦሽ ምርመራ (100 mg/ml) NT* (37 °C እና 60 °C)፣ NTA72R (37 °C) እና His-NT-L6 (37 °C እና 60 °C)።d የሲዲ የ NT ሚውቴሽን NT*፣ NTA72R እና His-NT-L6።በ 222 nm ላይ ያለው ሞላር ኤሊፕቲክ ወደ ተፈጥሯዊ እጥፋቶች መጠን ይለወጣል.ሠ የተገላቢጦሽ ሙከራ የNTFlSp፣ NTMiSp እና የተቀነሰ NTMiSp (100 mg/mL)።የመጠን ባር 5 ሚሜ.የ NT ፣ NTFlSp ፣ NTMiSp እና የተቀነሰ የ NTMiSp የሲዲ እይታ።በ 222 nm ላይ ያለው ሞላር ኤሊፕቲክ ወደ ተፈጥሯዊ እጥፋቶች መጠን ይለወጣል.በ25 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እና በ95 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ያለው ሙሉ የNT ስፔክትራ በማሟያ ምስል 8 ይታያል።
የፊዚዮሎጂያዊ የጨው ክምችት በ NT ንዑስ ክፍሎች መካከል ያለውን ኤሌክትሮስታቲክ መስተጋብር እና የ NT ማስተላለፍን ወደ ዝቅተኛ pH18 ማዛወር ይወስናል።የ 154 ሚሜ ናሲል እና ናኤፍ መገኘት ጄልሽንን እንደቅደም ተከተላቸው (ምስል 5 ሀ, ለ, ተጨማሪ ምስል 2 ለ) እና እነዚህ ጨዎች የ NT monomers የሙቀት መረጋጋት እንዲጨምሩ አድርጓል (ምስል 5b, ተጨማሪ ምስል 8) .በተጨማሪም የመረጋጋት ማሻሻያ, ከዳይሜሽን ይልቅ, ጄል እንዳይፈጠር ይከላከላል.
የፕሮቲን ዲሜራይዜሽን እና መረጋጋት በጌልሽን ውስጥ ያለውን ሚና የበለጠ ለመዳሰስ፣ ሁለት ሚውቴሽን፣ NT* እና NTA72R ተጠቀምን፣ እነዚህም በዝቅተኛ pH28.30 ሞኖሜሪክ ሆነው ይቀራሉ።NT* ባለ ሁለት ቻርጅ ተገላቢጦሽ ሚውቴሽን ሲሆን የሚታየው የሞኖሜር የዲፕሎላር ቻርጅ ስርጭቱ ጠፍጣፋ ሲሆን ይህም ዲሜራይዜሽንን ይከላከላል እና የሞኖሜር መረጋጋትን በእጅጉ ይጨምራል።NTA72R የተከሰሰ ዲፖል ነው፣ነገር ግን በአርግ የተካው አላ በዳይመር ወሰን ላይ ይገኛል፣ስለዚህ ሚውቴሽን ለማደብዘዝ በሚያስፈልገው ንዑስ መስተጋብር ውስጥ ጣልቃ ይገባል።በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ, NT * ሃይድሮጅል አልፈጠረም, NTA72R ግን ለ 15 ደቂቃዎች ግልጽ ያልሆነ ጄል ፈጠረ (ምስል 5c).ሁለቱም NT* እና NTA72R በሞኖሜር መረጋጋት (ምስል 5d) ሊለያዩ ስለማይችሉ፣ እነዚህ ውጤቶች ከፍተኛ ቴርሞዳይናሚክስ መረጋጋት NT ከጄልሚንግ ይከላከላል።ይህ ደግሞ በከፍተኛ ሙቀት (ከ 8 ደቂቃዎች በኋላ በ 60 ዲግሪ ሴንቲግሬድ, ምስል 5 ሐ) ላይ ኤችቲ * ጄል ይፈጥራል.ቀደም ሲል በአኪ ውስጥ ያለው የሜቲዮኒን ከፍተኛ ይዘት ተፈጥሯዊ መታጠፍን እንደሚያፈስ እና ስድስት ከሜት ወደ ሉ ምትክ (እዚህ His-NT-L6 ተብሎ የሚጠራው) የ NT46 ሞኖመርን በጠንካራ ሁኔታ እንደሚያረጋጋው ከዚህ ቀደም ታይቷል።ለኤንቲ ጄል ምስረታ መዋቅራዊ ተለዋዋጭነት ያስፈልጋል ከሚለው ግምት በመነሳት፣ የ His-NT-L6 ረጋ ሙታንት በ37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ (ምስል 5c፣ d) ላይ ጄል አላደረገም የሚል ግምት አግኝተናል።ነገር ግን፣ His-NT-L6 በ60 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ለ60 ደቂቃ (ምስል 5c) በመታቀፉ ​​ላይ ጄል ፈጠረ።
የአኪ ችሎታ ወደ β-sheet መዋቅሮች የመለወጥ እና ሃይድሮጅል ለመመስረት ያለው ችሎታ ለአንዳንዶቹ የ spidroin የአኪ ጎራዎች ላይ የሚተገበር ይመስላል።ኤንቲዎች ከተለያዩ የሐር ዓይነቶች እና የሸረሪት ዝርያዎች ፣ Trichonephila clavipes (NTFlSp) ፣ በአንጻራዊ ሁኔታ ዝቅተኛ የሜቲዮኒን ይዘት እና ከፍተኛ የሙቀት መረጋጋት ቢኖራቸውም ጄል ፈጠሩ (ምስል 5e ፣ f እና ተጨማሪ ሠንጠረዥ 2)።በአንጻሩ ኤን.ቲ ከትንሽ የአምፑላር ፕሮቲን ስፓይድሮይን ከአራነስ ventricosus (NTMiSp) ዝቅተኛ የሙቀት መረጋጋት እና ከፍተኛ የሜቲዮኒን ይዘት ያለው ሃይድሮጅል አልፈጠረም (ተጨማሪ ሠንጠረዥ 2 እና ምስል 5e, f).የኋለኛው የ intramolecular disulfide bonds መገኘት ጋር የተያያዘ ሊሆን ይችላል29,47.ያለማቋረጥ የ NTMiSp የዲሰልፋይድ ቦንዶች ሲቀነሱ በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 10 ደቂቃዎች (ምስል 5e) ከተፈጠረ በኋላ ሃይድሮጅል ፈጠረ.በማጠቃለያው ፣ መዋቅራዊ ተለዋዋጭነት አስፈላጊ ፣ ግን ብቸኛው ፣ ከአኪ ጄል መፈጠር መመዘኛ መሆኑን ልብ ሊባል ይገባል።ሌላው ጠቃሚ ሊሆን የሚችለው አሚሎይድ ፋይብሪልስ የመፍጠር ዝንባሌ ሲሆን ከዚፕ ዳታቤዝ እና ከዋልትዝ አልጎሪዝም ጋር የተደረገ ትንተና ጄል የመፍጠር ችሎታ እና አሚሎይድጂኒክ ክልሎች መኖር እንዲሁም የተተነበዩት ክልሎች ስፋት መካከል ያለውን ትስስር ያሳያል። ስቴሪክ ዚፐሮች ለመመስረት.ተያያዥነት ነበረው (ተጨማሪ ሠንጠረዥ 2 እና ተጨማሪ ምስል 9)።
የአኪ ፋይብሪል (fibrils) እና ምቹ በሆኑ ሁኔታዎች ውስጥ ጄል የመፍጠር ችሎታ የአኪ ውህዶች ከሌሎች የፕሮቲን ቁርጥራጮች ጋር አሁንም ሙሉ በሙሉ የተዋሃዱ አጋሮች ተግባር ያላቸው ጄል ሊፈጥሩ እንደሚችሉ እንድንገምት አድርጎናል።ይህንን ለመፈተሽ አረንጓዴ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (ጂኤፍፒ) እና ፑሪን ኑክሊዮሳይድ ፎስፈረስላይዝ (PNP) በC-terminus of NT በቅደም ተከተል አስተዋውቀናል።የተገኘው የውህደት ፕሮቲኖች በኢ.ኮላይ ውስጥ በጣም ከፍተኛ የመጨረሻ ምርት (150 mg/L እና 256 mg/L shake flask ባህሎች ለ His-NT-GFP እና His-NT-PNP በቅደም ተከተል) ከሚታየው ጋር ይጣጣማሉ። ለሌሎች ፕሮቲኖች ከኤን.ቲ. ማጣቀሻ.30. His-NT-GFP (300mg/mL) እና His-NT-PNP (100mg/mL) ውህድ ፕሮቲኖች ከ2 ሰአታት እና ከ6.5 ሰአታት በኋላ በ37 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ጄል ፈጠሩ እና በአስፈላጊ ሁኔታ የጂኤፍፒ ክፍልፋይ ሳይለወጥ ቀረ።ከጄልቴሽን በኋላ ይታያል,> 70% የመነሻው የፍሎረሰንት ጥንካሬ ከጄልሽን በኋላ ይቀራል (ምስል 6 ሀ).የፒኤንፒ እንቅስቃሴን በ his-NT-PNP መፍትሄዎች እና ጄልስ ለመለካት የንፁህ ዝግጅቱ ኢንዛይም እንቅስቃሴ በጂሊንግ ውህዶች ላይ ካለው የምርመራ ወሰን ውጭ ስለሆነ የውህደት ፕሮቲኑን ከኤንቲ ጋር መቀነስ ነበረብን።0.01 mg/mL His-NT-PNP እና 100 mg/mL NT በያዘው ድብልቅ የተሰራው ጄል 65% የቅድሚያ ኢንዛይም እንቅስቃሴን ቀደም ባሉት ናሙናዎች (ምስል 6 ለ) ይዞ ቆይቷል።በመለኪያ ጊዜ ጄል ሳይበላሽ ቆይቷል (ተጨማሪ ምስል 10).
አንጻራዊ የፍሎረሰንት ጥንካሬ His-NT-GFP (300 mg/mL) እና የተገለበጠ ብልቃጥ በውስጡ-ኤንቲ-ጂኤፍፒ ሃይሮጀል (300 mg/ml) በሚታይ እና በአልትራቫዮሌት ብርሃን ስር ከመውጣቱ በፊት እና በኋላ።ነጥቦች የግለሰብ መለኪያዎችን ያሳያሉ (n = 3)፣ የስህተት አሞሌዎች መደበኛ መዛባት ያሳያሉ።አማካይ እሴቱ በስህተት አሞሌዎች መሃል ላይ ይታያል።b የ PNP እንቅስቃሴ የተገኘው በፍሎሜትሪክ ትንተና መፍትሄዎች እና ጄል ኤንቲ (100 mg / ml) እና 0.01 mg/ml his-NT-PNP እና 100 mg/ml ኒው ታይዋን ዶላር የያዘ ድብልቅ ነው።ውስጠቱ His-NT-PNP (5 ሚሜ ሚዛን ባር) የያዘ ሃይድሮጅል የያዘ የተገለበጠ ጠርሙዝ ያሳያል።
እዚህ ላይ የፕሮቲን መፍትሄን በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ (ምስል 1) ውስጥ በማፍለቅ የሃይድሮጅን ከኤንቲ እና ሌሎች ዳግመኛ የ spidroin ፕሮቲኖች መፈጠሩን ሪፖርት እናደርጋለን.ጄልሽን ከ α-helices ወደ β-ንብርብሮች መለወጥ እና አሚሎይድ የሚመስሉ ፋይብሪሎች ከመፍጠር ጋር የተያያዘ መሆኑን እናሳያለን (ምስል 3 እና 4).ይህ ግኝት አስገራሚ ነው ኤንቲዎች የተጠቀለሉ ግሎቡላር ባለ አምስት ሄሊክስ ጥቅሎች እጅግ በጣም ከፍተኛ በሆነ የመሟሟት እና ከፍተኛ መረጋጋት በ>200 mg/mL በ4°C ለብዙ ቀናት27።በተጨማሪም፣ ኤንቲዎች በµM ውስጥ ባለው ዝቅተኛ የፕሮቲን ውህዶች የሙቀት መጠኑ ከተቀነሰ በኋላ በቀላሉ ይገለበጣሉ።እንደ ውጤታችን, ፋይብሪል መፈጠር> 10 mg / ml የፕሮቲን ውህደት እና ትንሽ ከፍ ያለ የሙቀት መጠን ያስፈልገዋል (ምስል 1).ይህ አሚሎይድ ፋይብሪልስ በፊዚዮሎጂ ሁኔታዎች ውስጥ ባለው የሙቀት መለዋወጥ ምክንያት በከፊል ባልተሸፈነ ሁኔታ ውስጥ ካሉ ግሎቡላር የታጠፈ ፕሮቲኖች ሊፈጠሩ ይችላሉ ከሚለው ሀሳብ ጋር ይጣጣማል 48 .በዚህ ለውጥ ውስጥ ያሉ ፕሮቲኖች ምሳሌዎች ኢንሱሊን49,50, β2-microglobulin, transthyretin እና lysozyme51,52,53 ያካትታሉ.ምንም እንኳን NT በትውልድ አገሩ ውስጥ α-ሄሊክስ ቢሆንም በግምት 65% የሚሆነው የ polypeptide ሰንሰለት ከስቴሪክ ዚፕ አሠራር (ምስል 4e) 45 ጋር ተኳሃኝ ነው።ሞኖሜር በተለዋዋጭ ሞባይል 46 ስለሆነ እነዚህን እምቅ አሚሎይዶጅኒክ ክልሎችን በመጠኑ ከፍ ባለ የሙቀት መጠን ሊያጋልጥ ይችላል እና ከፍተኛ መጠን ያለው የፕሮቲን መጠን ለአሚሎይድ ፋይብሪል ምስረታ54 ወሳኝ ትኩረት ሊደርስ ይችላል።ይህን ምክንያት ተከትሎ፣ በ spidroin ትኩረት እና በጌልታይን ጊዜ (ምስል 1 ሐ) መካከል አሉታዊ ትስስር አግኝተናል፣ እና የሞኖሜሪክ ኤንቲ ኮንፎርሜሽን በሚውቴሽን (NT*፣ His-NT-L6) ወይም በጨው መጨመር ከተረጋጋ፣ ምስረታ hydrogels (ምስል 5).
በአብዛኛዎቹ ሁኔታዎች አሚሎይድ ፋይብሪሎች ከመፍትሔው እንደ ዝናብ ይጠፋሉ, ነገር ግን በተወሰኑ ሁኔታዎች ውስጥ ሃይድሮጅል 55,56,57 ሊፈጥሩ ይችላሉ.ሃይድሮጅል የሚፈጥሩ ፋይብሪሎች ብዙውን ጊዜ ከፍተኛ ምጥጥነ ገጽታ አላቸው እና የተረጋጋ ሶስት አቅጣጫዊ አውታረ መረቦችን በሞለኪውላዊ ጥልፍልፍ ይመሰርታሉ፣55,58 ከውጤታችን ጋር ይጣጣማሉ።በብልቃጥ ውስጥ ለሃይድሮጂል ምስረታ ፕሮቲኖች ብዙውን ጊዜ ሙሉ በሙሉ ወይም በከፊል ይገለጣሉ ፣ ለምሳሌ ፣ ለኦርጋኒክ መሟሟት በመጋለጥ ፣ ከፍተኛ ሙቀት (70-90 ° ሴ) እና / ወይም ዝቅተኛ ፒኤች (1.5-3.0) 59,60,61,62።እዚህ የተገለጹት የ spidroin hydrogels ጠንከር ያለ ሂደትን አይጠይቁም, እንዲሁም ሃይድሮጅንን ለማረጋጋት ተሻጋሪ ወኪሎች አያስፈልጋቸውም.
ቀደም ሲል ስፓይድሮይን ይደግማል እና በሐር በሚሽከረከርበት ጊዜ የ β-sheet መቀያየርን የሚመስሉ QDs ሃይድሮጂል እንደሚፈጠሩ ተዘግቧል።ከግኝታችን ጋር ሲነጻጸር፣ የመፈልፈያ ጊዜ እና/ወይም የመታቀፉ የሙቀት መጠን በከፍተኛ ደረጃ ረዘም ያለ ወይም ከፍ ያለ ነበር፣ እና የውጤቶቹ ሃይድሮጅሎች ብዙ ጊዜ ግልጽ ያልሆኑ ነበሩ (ምስል 7 እና ተጨማሪ ሠንጠረዥ 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. ከፈጣን የጄል ጊዜዎች በተጨማሪ ኤንቲ ሃይድሮጅልስ>300 mg/ml (30%) ከሌሎች የተገለጹት ዳግም የተዋሃዱ የሸረሪት ሐር ፕሮቲን ሃይድሮጅልስ፣ እንዲሁም እንደ ጄልቲን፣ አልጀንት (2%)፣ agar (0.5%) ያሉ የተፈጥሮ ሃይድሮጅሎችን የላቀ ውጤት አስመዝግቧል። ) እና ኮላጅን.(0.6%) (ስእል 7 እና ተጨማሪ ሠንጠረዥ 1 እና 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
በዚህ ጥናት ውስጥ የሃይድሮጅልስ ጄል ጊዜ እና የመለጠጥ ሞጁል ከሌሎች ስፓይድሮይን ላይ የተመሰረቱ ሀይድሮጅሎች እና ከተመረጡት የተፈጥሮ ሀይድሮጅሎች ጋር ተነጻጽሯል።ማመሳከሪያዎች ስለ ጄልሽን ሁኔታዎች መግለጫዎች ተሰጥተዋል.APS Ammonium persulfate፣ የክፍል ሙቀት።መረጃ 37 ፣ 38 ፣ 39 ፣ 64 ፣ 65 ፣ 66 ፣ 67 ፣ 68 ፣ 69 ፣ 70 ፣ 71 ፣ 72 ፣ 73 ፣ 74 ።
ሸረሪቶች በማከማቻ ጊዜ ስፒሮይንን ከጄልሊን ለመከላከል የሚያስችሉ መንገዶችን ያዘጋጁ ይመስላል.በሐር እጢ ውስጥ ያለው ከፍተኛ የፕሮቲን ክምችት ቢኖርም ፣ ከተርሚናል ዶሜይን ጋር የተገናኘው ትልቅ ድግግሞሽ ማለት በዚህ ጥናት ወሰን ላይ ያለው የ NT እና CT በ gland ውስጥ ያለው ግልጽ ትኩረት በግምት ከ10-20 mg/ml ጋር ይዛመዳል።በብልቃጥ ውስጥ ለታየው የሃይድሮጅል አሠራር ያስፈልጋል.በተጨማሪም ፣ ተመሳሳይ የጨው ክምችት 16 ኤንቲ የተረጋጋ ፣ እንደ ሐር እጢዎች (ምስል 5 ለ)።የኤን.ቲ ኮንፎርሜሽን በኢ.ኮሊ ሳይቶሶል ውስጥ የተመረመረ ሲሆን በብልቃጥ ውስጥ ከተመረመሩት ይልቅ በጥብቅ የታጠፈ ሆኖ ተገኝቷል፣ ይህም ጨው ወይም ሌሎች ነገሮች በ Vivo ውስጥ እንዳይሰበሰቡ እንደሚከላከሉ ያሳያል።ነገር ግን፣ የኤን.ቲ.ዎች ወደ β-sheet fibrils የመቀየር ችሎታ ፋይበርን ለመፍጠር አስፈላጊ ሊሆን ስለሚችል ወደፊት በሚደረጉ ጥናቶች መመርመር አለበት።
በዚህ ጥናት ውስጥ ከተስተዋሉት የ NT-amyloid-like fibril እና hydrogel ምስረታ ልብ ወለድ ገጽታዎች በተጨማሪ, ይህ ክስተት ባዮቴክኖሎጂያዊ እና ባዮሜዲካል አፕሊኬሽኖች (ምስል 8) ሊኖረው እንደሚችል እናሳያለን.ለጽንሰ-ሃሳብ ማረጋገጫ፣ ኤንቲን ከጂኤፍፒ ወይም ፒኤንፒ ጋር በማጣመር የውህደት ፕሮቲን በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ሲጨመር ሃይድሮጅሎችን እንደሚፈጥር እና የጂኤፍፒ እና ፒኤንፒ ክፍልፋዮች ከጂልሽን በኋላ እንቅስቃሴያቸውን እንደያዙ አሳይተናል (ምስል 6)።Nucleoside phosphorylases የኑክሊዮሳይድ analogues75 ውህደቶች ጠቃሚ ማበረታቻዎች ናቸው፣ ይህም ግኝታችንን ለባዮፋርማሱቲካል ኢንዱስትሪ ጠቃሚ ያደርገዋል።ምቹ ሁኔታዎች ውስጥ ግልጽ hydrogels ለመመስረት መሆኑን Fusion ፕሮቲኖች የመግለፅ ጽንሰ-ሐሳብ እንደ ኢንዛይም የማይነቃነቅ, ቁጥጥር ዕፅ መለቀቅ እና ቲሹ ምሕንድስና እንደ መተግበሪያዎች ሰፊ ክልል ጋር functionalized hydrogels ምቹ ንብረቶች መፍጠር ያስችላል.በተጨማሪም፣ NT እና NT* ቀልጣፋ አገላለጽ ማርከር30 ናቸው፣ ይህ ማለት ኤንቲ እና ተለዋጮች በከፍተኛ ደረጃ የሚሟሟ ውህድ ፕሮቲኖችን ለማምረት እና በቀጣይ በ3D ሃይድሮጅል ውስጥ የማይንቀሳቀሱ ዒላማ ፕሮቲኖችን ለመፍጠር ሊያገለግሉ ይችላሉ።
NT የሚሟሟ፣ α-ሄሊካል እና በዝቅተኛ ክምችት (µM) እና 37°ሴ የተረጋጋ ነው።በተመሳሳዩ የሙቀት መጠን, ነገር ግን እየጨመረ በሚሄድ መጠን (> 10 mg / ml), NT አሚሎይድ የሚመስሉ ፋይብሪሎችን ያካተቱ ጄልዎችን ይፈጥራል.የኤን ቲ ፊውዥን ፕሮቲኖች ፋይብሪላር ጄልስን ሙሉ ለሙሉ የሚሰሩ የውህደት ቁርጥራጮች ይፈጥራሉ፣ ይህም የተለያዩ ፕሮቲኖች ኤንቲን በመጠቀም በ3D ሀይድሮጅል ውስጥ እንዳይንቀሳቀሱ ያስችላቸዋል።ከታች፡ ኤንቲ (ፒዲቢ፡ 4ኤፍቢኤስ) እና የፋይበር ኔትወርኮች እና ተያያዥ የፕሮቲን አወቃቀሮች ምሳሌዎች (ተገመተው እና ወደ ሚዛን ያልተሳቡ፣ GFP PDB፡ 2B3Q፣ 10.2210/pdb2B3Q/pdb፤ PNP PDB፡ 4RJ2፣ 10.2210/2Pdb4)።
ግንባታዎቹ (የአሚኖ አሲድ ቅደም ተከተሎችን ጨምሮ ለተሟላ ዝርዝር ማሟያ ሠንጠረዥ 4 ይመልከቱ) ወደ ፕላዝማድ pT7 ተቀይረው ወደ E.coli BL21 (DE3) ተቀይረዋል።ኢ. ኮላይ ኢንጂነሪንግ ፕላዝማይድ የያዙት በሉሪያ ብሮድ በካናሚሲን (70 mg/l) የተጨመረ ሲሆን በአንድ ሌሊት በ 30 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እና 250 ራፒኤም አድጓል።ባህሉ 1/100 ካናሚሲን በያዘ LB መካከለኛ ተከተተ እና በ30°C እና 110 ደቂቃ በሰለምለም OD600 0.8 እስኪደርስ ድረስ።ለኤንኤምአር ጥናቶች፣ ባክቴሪያዎች በM9 አነስተኛ መካከለኛ መጠን ውስጥ ይበቅላሉ፣ 2 g D-glucose 13C (Aldrich) እና 1 g ammonium chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) ለፕሮቲን መለያ ከአይሶቶፖች ጋር።የሙቀት መጠኑን ወደ 20 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ዝቅ ያድርጉ እና የፕሮቲን መግለጫን በ 0.15 ሚሜ ኢሶፕሮፒልቲዮጋላክቶፒራኖሳይድ (የመጨረሻ ትኩረት) ያነሳሱ።ከአንድ ምሽት የፕሮቲን መግለጫ በኋላ, ሴሎች በ 7278 × g, 4 ° ሴ ለ 20 ደቂቃዎች ተሰብስበዋል.የሕዋስ እንክብሎች በ20 ሚሜ ትሪስ-ኤች.ሲ.ኤል፣ ፒኤች 8፣ እና ተጨማሪ ጥቅም ላይ እስኪውሉ ድረስ ታግደዋል።የቀለጠ ህዋሶች በ30 ኪ.ፒ.ኤ በሴል ረብሻ (ቲኤስ ተከታታይ ማሽኖች፣ ኮንስታንት ሲስተምስ ሊሚትድ ፣ እንግሊዝ) በመጠቀም ተቀባ።ከዚያም በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 30 ደቂቃዎች በ 25,000 ግራም ሊዛዎች በሴንትሪፉድ.ለ NTMiSp፣ እንክብሉ በ2M ዩሪያ፣ 20 ሚሜ ትሪስ-ኤች.ሲ.ኤል፣ ፒኤች 8፣ እና ለ 2 ደቂቃ ተጠርቷል (2 ሰከንድ በርቷል፣ 65%)፣ ከዚያም እንደገና በ25,000 xg፣ 4°C. 30 ደቂቃየሱፐርኔቱ ንጥረ ነገር በኒ-ኤንቲኤ አምድ ላይ ተጭኖ በ 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8 ታጥቧል, እና በመጨረሻም ፕሮቲኑ በ 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. NT2RepCT እና ለማመንጨት. NTCT፣ thrombin የምግብ መፈጨት ቦታን (ThrCleav) በ His እና NT መካከል ያስተዋውቃል።የ Thrombin cleavage ሳይቶች በ His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep ያመርታል)፣ His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT ያዘጋጃል)፣ His-thioredoxin-ThrCleav-CT (ሲቲ ያዘጋጃል)፣ ሂስ-Thioredoxin-ThrCleav-NT ውስጥ ይገኛሉ። .* (NT* ያመርታል)፣ His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R ያዘጋጃል)፣ His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp ያመርታል) እና His-sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (NTMiSp ያዘጋጃል)።ግንባታዎቹ በቲምብሮቢን (1፡1000) ተፈጭተው በአንድ ሌሊት በ4° ሴ. በ20 mM Tris-HCl፣ pH 8፣ በ Spectra/Por ዳያሊስስ ሽፋን ከ6-8 ኪ.ዲ.ከዳያሊስስ በኋላ, መፍትሄው በኒ-ኤንቲኤ አምድ ላይ ይጫናል እና የፍላጎት ፕሮቲን ያለው ፈሳሽ ይሰበስባል.የፕሮቲን ውህዶች የሚወሰኑት በአምራቹ ፕሮቶኮል መሰረት የብሬድፎርድ ምርመራን ከተጠቀመው NTF1Sp በስተቀር የእያንዳንዱን ፕሮቲን የመጥፋት መጠን በመጠቀም በ 280 nm UV absorbanceን በመለካት ነው።ንፅህና የሚወሰነው በኤስዲኤስ ፖሊacrylamide (4-20%) ጄል ኤሌክትሮፊዮሬሲስ እና በኮማሴ ደማቅ ሰማያዊ ቀለም ነው።ፕሮቲኖች በሴንትሪፉጅ ማጣሪያዎች (VivaSpin 20, GE Healthcare) በ 4000 xg በ 10 kDa ሞለኪውላዊ ክብደት በ 20 ደቂቃ ዑደቶች ውስጥ ተከማችተዋል.
የፕሮቲን መፍትሄውን ይቀልጡ እና በጥንቃቄ 150 µl ወደ 1 ሚሊር የተጣራ የሴፕተም ብልቃጥ (8 x 40 ሚሜ ቴርሞ ሳይንቲፊክ) ውስጥ ይግቡ።ቱቦዎቹ በትነት እንዳይወጡ ተዘግተው በፓራፊልም ተዘግተዋል።ናሙናዎች (n = 3) በ 37 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ወይም በ 60 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ተቀርፀዋል እና ጄልቲንን ለመመልከት በየጊዜው ይገለበጣሉ.ጄል ያላደረጉ ናሙናዎች ቢያንስ ለአንድ ሳምንት ተክለዋል.የ NTMiSp ዲሰልፋይድ ቦንዶችን በ10 ሚሜ ዲቲቲ በ10 μM ፕሮቲን ይቀንሱ።የተፈጥሮ ሸረሪት የሐር ሽፋኖችን ቅልጥፍና ለመተንተን የስዊድን ድልድይ ሸረሪት ተቆርጧል, ሁለቱ ዋና ዋና የተቆራረጡ እጢዎች በ 200 μl 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 ውስጥ ተቀምጠዋል እና ሽፋኑ ከእጢዎች እንዲለይ ተቆርጧል..የእጢዎቹ ይዘት በመጠባበቂያ ውስጥ ይሟሟል፣ 50 µl ደረቅ ክብደትን ለመወሰን (ክፍት ጠርሙሶች በ60 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እስከ ቋሚ ክብደት) እና 150 µl ለጄልሽን በ37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ።
የመለኪያ ጂኦሜትሪ/መሳሪያው ከማይዝግ ብረት የተሰራው 20 ሚሊ ሜትር የሆነ የላይኛው ዲያሜትር እና 0.5 ሚሜ ልዩነት ያለው ትይዩ ሰሃን በመጠቀም ነው።ናሙናውን ከ 25 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እስከ 45 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እና ወደ 25 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ በ 1 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ፍጥነት በደቂቃ ከማይዝግ ብረት በታች ያለውን የፔልቲየር ሳህን ይጠቀሙ.የንዝረት መለኪያዎች በ 0.1 Hz ድግግሞሽ እና በመስመራዊ የቪስኮላስቲክ ክልል ውስጥ ቁሳቁስ በ 5% እና በ 0.5% ለ 100 mg / ml እና 300-500 mg / ml ናሙናዎች በቅደም ተከተል ተካሂደዋል.ትነት ለመከላከል ብጁ የእርጥበት ክፍል ይጠቀሙ።መረጃ የተተነተነው ፕሪዝም 9ን በመጠቀም ነው።
ከ 800 እስከ 3900 ሴ.ሜ -1 ባለው የሙቀት መጠን የኢንፍራሬድ (IR) ስፔክትሮችን ለመሰብሰብ.የኤቲአር መሳሪያው እንዲሁም በስፔክትሮሜትር በኩል ያለው የብርሃን መንገድ ከሙከራው በፊት እና በደረቅ የተጣራ አየር ይጸዳል።መፍትሄዎች (500 mg / mL በስፔክተሩ ውስጥ የውሃ መሳብ ቁንጮዎችን ለመቀነስ) ወደ ክሪስታሎች ላይ በፓይፕ ተጭነዋል ፣ እና ጄል (500 mg / mL) ከመለካቱ በፊት ተፈጥረዋል ከዚያም ወደ ክሪስታሎች (n = 3) ተላልፈዋል።1000 ስካን በ 2 ሴ.ሜ-1 ጥራት እና ዜሮ የግዴታ ዑደት 2. ሁለተኛው ውፅዓት በ OPUS (Bruker) በመጠቀም የተሰላ ዘጠኝ ነጥቦችን የማቀላጠፍ ክልል በመጠቀም ነው.ስፔክተራው በ 1720 እና 1580 ሴ.ሜ -1 መካከል ወደ ተመሳሳይ ውህደት ክልል መደበኛ እንዲሆን የተደረገው F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" በመጠቀም ነው.በ ATR-IR ስፔክትሮስኮፒ ውስጥ የኢንፍራሬድ ጨረር ወደ ናሙና ውስጥ ዘልቆ የሚገባው ጥልቀት በሞገድ ቁጥር ላይ የተመሰረተ ነው, በዚህም ምክንያት ከፍ ካለ የሞገድ ቁጥሮች ይልቅ በዝቅተኛ የሞገድ ቁጥሮች ላይ የበለጠ ጥንካሬን ያመጣል.እነዚህ ተጽእኖዎች በምስል ላይ ለሚታየው ስፔክትራ አልተስተካከሉም.3 በጣም ትንሽ ስለሆኑ (ተጨማሪ ምስል 4).ለዚህ አኃዝ የተስተካከለ ስፔክትራ የተሰላው የብሩከር OPUS ሶፍትዌርን በመጠቀም ነው።
በመርህ ደረጃ, በአሚድ I ፒክ ውስጥ ያሉትን ክፍሎች አስተማማኝ መፍታት ከተረጋገጠ በኋላ አጠቃላይ የፕሮቲን ውህዶችን መለየት ይቻላል.ይሁን እንጂ አንዳንድ መሰናክሎች በተግባር ይነሳሉ.በድምፅ ማጥፋት ጊዜ ጩኸት እንደ (ሐሰት) ጫፎች ሊመጣ ይችላል።በተጨማሪም በውሃ መታጠፍ ምክንያት ከፍተኛው ከፍታ ከአሚድ I ፒክ አቀማመጥ ጋር ይጣጣማል እና ከፍተኛ መጠን ያለው ውሃ ለያዙ ናሙናዎች ተመሳሳይ መጠን ሊኖረው ይችላል ፣ ለምሳሌ የውሃ ጄል እዚህ ጥናት።ስለዚህ, የአሚድ I ጫፍን ሙሉ በሙሉ ለመበስበስ አልሞከርንም, እና የእኛ ምልከታዎች እንደ NMR spectroscopy ያሉ ሌሎች ዘዴዎችን ለመደገፍ ብቻ ግምት ውስጥ መግባት አለባቸው.
የ 50 mg/ml NT እና His-NT2RepCT መፍትሄዎች በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ በአንድ ጀምበር ተሞልተዋል።ከዚያም ሃይድሮጄል በ 20 mM Tris-HCl (pH 8) ወደ 12.5 ሚ.ግ. / ሚሊ ሊትር, በደንብ ይንቀጠቀጣል እና ጄል ለመስበር በፓይፕ ተጣብቋል.በመቀጠልም ሃይድሮጄል በ 20 ሚሜ ትሪ-ኤች.ሲ.ኤል (pH 8) 10 ጊዜ ተጨምሯል, 5 μl ናሙና በፎርምቫር በተሸፈነው የመዳብ ፍርግርግ ላይ ተተክሏል, እና ከመጠን በላይ ናሙና በጠፍጣፋ ወረቀት ተወግዷል.ናሙናዎች በ 5 μl ሚሊኪው ውሃ ሁለት ጊዜ ታጥበው በ 1% ዩራኒል ፎርማት ለ 5 ደቂቃዎች ተበክለዋል.ከመጠን በላይ ቆሻሻን በሚስብ ወረቀት ያስወግዱ ፣ ከዚያ መረቡን ያድርቁት።በ100 ኪሎ ቮልት የሚሠራ FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN በመጠቀም በእነዚህ ፍርግርግ ላይ ኢሜጂንግ ተከናውኗል።ምስሎቹ የተቀረጹት በ x 26,500 እና x 43,000 ማጉላት በVeleta 2k × 2k CCD ካሜራ (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany) በመጠቀም ነው።ለእያንዳንዱ ናሙና (n = 1), 10-15 ምስሎች ተመዝግበዋል.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ምስልን ለመተንተን እና የፋይበር ዲያሜትሮችን ለመለካት ጥቅም ላይ ውሏል (n = 100 ፣ የተለያዩ ፋይበርዎች)።ፕሪዝም 9 ያልተጣመሩ ቲ-ሙከራዎችን (ሁለት ጭራዎች) ለማከናወን ጥቅም ላይ ውሏል።አማካይ His-NT2RepCT እና NT fibrils 11.43 (SD 2.035) እና 7.67 (SD 1.389) nm ነበሩ፣ በቅደም ተከተል።የመተማመን ክፍተት (95%) -4.246 እስከ -3.275.የነፃነት ደረጃዎች = 198, p <0.0001.
10 µM thioflavin T (ThT) የያዙ 80 µl ፈሳሽ ናሙናዎች በሶስት እጥፍ (n = 3) በስታቲክ ሁኔታዎች ኮርኒንግ 96-በደንብ ጥቁር የታችኛው ግልጽ የታችኛው ሰሌዳዎች (ኮርኒንግ መስታወት 3881, USA) በመጠቀም ይለካሉ.የፍሎረሰንት ልዩነት በ 440 nm excitation ማጣሪያ እና 480 nm ልቀት ማጣሪያ (FLUOSstar Galaxy ከ BMG Labtech, Offenburg, Germany) በመጠቀም ተመዝግቧል.የተለያየ የThT ይዘት ያላቸው ሙከራዎች የምልክት መጠኑን ሳይቀይሩ ስለሚደረጉ የTHT ምልክት አልጠገበም ወይም አልጠፋም።ለጭጋግ መለኪያ በ 360 nm መምጠጥ ይመዝግቡ.ለዘር ሙከራዎች 100 mg/ml gels በ 37° ሴ.፣ እንደገና ታግዶ እና በ 5%፣ 10% እና 20% የሞላር መጠን ለመዝራት ጥቅም ላይ ይውላል።መረጃ የተተነተነው ፕሪዝም 9ን በመጠቀም ነው።
የ His-NT2RepCT እና NT>100 mg/mL ክምችቶችን በበረዶ ላይ ይቀልጡ እና በ0.22µm ማጣሪያ ያጣሩ።ማጎሪያዎቹ ናኖድሮፕን በመጠቀም በ 280 nm የመጠጣትን መጠን በመለካት ይሰላሉ.በ 96 ጉድጓድ ውስጥ ጥቁር የማይታሰር ጠፍጣፋ (ኮርኒንግ) ጥርት ባለው የታችኛው ክፍል ውስጥ, ናሙናዎች በ 20 ሚ.ሜትር Tris-HCl pH 8 ውስጥ ወደ 20 mg / ml እና ከ 5 μM ThT (የመጨረሻው ትኩረት) ጋር ተቀላቅለዋል, አጠቃላይ የናሙና ትኩረት. 50 ሚሊ ሊትር.ናሙናዎች በየ10 ደቂቃው በ37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ በሴል ኦብሰርቨር (ዘይስ) ማይክሮስኮፕ ከሚተላለፉ የብርሃን ቻናል እና FITC አበረታች እና ልቀት ማጣሪያ ስብስቦች ለTHT ምስል ይቀርባሉ።20x/0.4 መነፅር ለምስል ስራ ላይ ይውላል።Zen Blue (Zeiss) እና ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ለምስል ትንተና ጥቅም ላይ ውለዋል።ጄል እንዲሁ ከ NT እና His-NT2RepCT መፍትሄዎች በ 50 mg/mL 20 mM Tris pH 8 እና 5 μM ThT በያዘ እና በ37°C ለ90 ደቂቃ ተዘጋጅቷል።የጄል ቁርጥራጮቹ 20 ሚሜ ትሪስ ፣ ፒኤች 8 እና 5 μM ThT ወደያዘ አዲስ ጉድጓድ ተላልፈዋል በማያያያዝ ጥቁር 96 በደንብ ግልፅ የታችኛው ሳህን።አረንጓዴ ፍሎረሰንት እና ብሩህ የመስክ ምስሎችን በ20x/0.4 ማጉላት ያግኙ።ImageJ ለምስል ትንተና ጥቅም ላይ ውሏል።
የመፍትሄው NMR ስፔክትራ በ 310 K በ 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) የተገጠመለት።NMR ናሙናዎች 10 mg/mL ተመሳሳይ የሆነ ፕሮቲን በ13C፣ 15N፣ በ20 mM Tris-HCl (pH 8) የሚሟሟት፣ 0.02% (ወ/ቪ) NaN3፣ 5% DO (v/v)፣ (n = 1) .የ NT2RepCT ኬሚካላዊ ለውጦች በ pH 6.7 በ2D ስፔክትረም 15N-HSQC ውስጥ 23 ን ለመመደብ ጥቅም ላይ ውለዋል።
Magic angle spinning solid NMR (MAS) spectra 13C፣ 15N-Labeled hydrogels በBruker Avance III HD spectrometer በ800 ሜኸር በ3.2 ሚሜ 13C/15N{1H} ኤሌክትሮን አልባ መፈተሻ።የናሙና የሙቀት መጠን በተለዋዋጭ የሙቀት ጋዝ ዥረት በ 277 ኪ. ሁለት-ልኬት ዲፖል ሮታሽናል ሬዞናንስ (DARR) 76 እና የሬዲዮ ፍሪኩዌንሲ (RFDR) 77 ስፔክተሮች በ MAS ድግግሞሽ በ 12.5 kHz እና 20 kHz ተገኝተዋል።ክሮስ ፖላራይዜሽን (ሲፒ) ከ1H እስከ 13C የሚካሄደው ከ60.0 እስከ 48.0 kHz በ 1H፣ 61.3/71.6 kHz በ 13C (በ12.5/20 kHz MAS) እና የግንኙነት ጊዜ 0.5-1 ms በመጠቀም ነው።Spinal6478 በ 73.5 kHz መፍታት በመረጃ አሰባሰብ ወቅት ጥቅም ላይ ውሏል።የግዢው ጊዜ 10 ሚሊሰከንዶች ሲሆን የዑደቱ መዘግየት 2.5 ሰከንድ ነበር።በ RFDR spectra ውስጥ የተስተዋሉት ነጠላ-ተያያዥ የCα/Cβ ግኑኝነቶች የተመደቡት በባህሪያዊ ቅሪት ዓይነት ኬሚካላዊ ለውጦች እና በ DARR ስፔክትራ ውስጥ ባለ ብዙ ተያያዥነት ባላቸው ግንኙነቶች ላይ በመመስረት ነው።
የዚፕፐር79 ዳታቤዝ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) የመብረቅ ዝንባሌዎችን እና የሮሴታ ሃይልን ለNT፣ NTFLSp እና NTMiSp ለመገምገም ጥቅም ላይ ውሏል።የዚፕር ዳታቤዝ Rosetta Energy80ን ያሰላል፣ ይህም የፕሮቲን መዋቅርን ለመቅረጽ እና ለመተንተን በርካታ የነጻ ሃይል ተግባራትን ያጣምራል።የኢነርጂ መጠን -23 kcal / mol ወይም ዝቅተኛ የፋይብሪሌትስ ከፍተኛ ዝንባሌን ያመለክታል.ዝቅተኛው ጉልበት ማለት በዚፕር ኮንፎርሜሽን ውስጥ የሁለቱ β-ክሮች የበለጠ መረጋጋት ማለት ነው.በተጨማሪም፣ የዋልትዝ ስልተ ቀመር በNT፣ NTFlSp እና NTMiSp Ref ውስጥ አሚሎይድጂኒክ ክልሎችን ለመተንበይ ጥቅም ላይ ውሏል።81. (https://waltz.switchlab.org/)።
የ NT ፕሮቲን መፍትሄ ከ 2- (N-morpholino) ኤታነሱልፎኒክ አሲድ (MES) ቋት በ pH 5.5 እና 6.0 ተቀላቅሏል ፒኤች ወደ pH 6 እና 7 በቅደም ተከተል።የመጨረሻው የፕሮቲን መጠን 100 mg / ml ነው.
መለኪያዎች በ J-1500 CD spectrometer (JASCO, USA) ላይ በ 300 μL ኩቬት በመጠቀም በ 0.1 ሴ.ሜ የኦፕቲካል መንገድ ተካሂደዋል.ፕሮቲኖች በ 20 ሚሜ ፎስፌት ቋት (pH 8) ውስጥ ወደ 10 μM (n = 1) ተበርዘዋል።ጨው በሚኖርበት ጊዜ የፕሮቲን መረጋጋትን ለመተንተን, ፕሮቲኖች በ 20 ሚሜ ፎስፌት ቋት (pH 8) ውስጥ 154 ሚሜ NaF ወይም NaCl በያዘው ተመሳሳይ መጠን (n = 1) ውስጥ ተንትነዋል.የሙቀት ቅኝቶች በ 222 nm ከ 25 ° ሴ እስከ 95 ° ሴ በ 1 ° ሴ / ደቂቃ የሙቀት መጠን ተመዝግበዋል.በአገር ውስጥ የታጠፈ ፕሮቲኖች መጠን በቀመር (KDmeasure - KDfinal)/(KDstart - KDfinal) በመጠቀም ይሰላል።በተጨማሪም ለእያንዳንዱ ናሙና ከ 260 nm እስከ 190 nm በ 25 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እና ከሙቀት በኋላ እስከ 95 ° ሴ ድረስ አምስት ስፔክተሮች ተመዝግበዋል.አምስት ስፔክተራዎች በአማካይ ተስተካክለው ወደ ሞላር ኤሊፕቲቲነት ተለውጠዋል።መረጃ የተተነተነው ፕሪዝም 9ን በመጠቀም ነው።
የHis-NT-GFP (300 mg/mL፣ 80 µL) የፍሎረሰንት መጠን በሶስት እጥፍ (n= 3) በ96-ዌል ኮርኒንግ ሳህኖች ከጥቁር ገላጭ የታችኛው ክፍል (ኮርኒንግ መስታወት 3881፣ ዩኤስኤ) በቋሚ ሁኔታዎች ይለካሉ።ናሙናዎችን በፍሎረሰንስ ላይ በተመረኮዘ ሳህን አንባቢ በ395 nm አበረታች የሞገድ ርዝመት ይለኩ እና ልቀቱን በ509 nm ከጀልቴሽን በፊት እና ከ2 ሰአታት በኋላ በ37°C ይመዝግቡ።መረጃው ከPrism 9 ጋር ተንትኗል።
በአምራቹ መመሪያ መሰረት የፑሪን ኑክሊዮሳይድ ፎስፈረስላዝ እንቅስቃሴ መመዘኛ ኪት (ፍሎሮሜትሪክ ዘዴ፣ ሲግማ አልድሪች) ጥቅም ላይ ውሏል።ሂስ-ኤንቲ-ፒኤንፒን የያዙ መፍትሄዎችን ለመለካት 10ng His-NT-PNP ከ100 mg/ml NT ጋር በድምሩ 2µL መጠን 2 μL ያዋህዱ።የጂልስ መቆጣጠሪያዎች እና መፍትሄዎች ያለ His-NT-PNP ተካተዋል.መለኪያዎቹ ሁለት ጊዜ ተካሂደዋል (n = 2).እንቅስቃሴው ከተለካ በኋላ, የምላሽ ድብልቅው ተወግዶ እና ጄል በመለኪያ ጊዜ ሳይበላሽ መቆየቱን ለማረጋገጥ ጄል ፎቶግራፍ ተነስቷል.መረጃ የተተነተነው ፕሪዝም 9ን በመጠቀም ነው።
በጥናት ንድፍ ላይ ተጨማሪ መረጃ ለማግኘት ከዚህ ጽሑፍ ጋር የተያያዘውን የተፈጥሮ ጥናት ረቂቅ ይመልከቱ።
ምስል 1 እና 2 የመጀመሪያውን መረጃ ያቀርባል.1c፣ 2a–c፣ 3a፣ b፣ e–g፣ 4፣ 5b፣ d፣ f እና 6፣ ተጨማሪ ስእል።3, ተጨማሪ በለስ.5a, d, ተጨማሪ በለስ.6 እና ተጨማሪ በለስ.8. ከዚህ ጥናት የተገኘው መረጃ በዜኖዶ ዳታቤዝ https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 ውስጥ ተስተናግዷል።በዚህ ጥናት ውስጥ የተገኘው የNMR መረጃ በ BMRBig ማከማቻ ውስጥ በመግቢያ መታወቂያ bmrbig36 ላይ ተለጠፈ።የጂኤፍፒ እና ፒኤንፒ አወቃቀሮች የተወሰዱት ከፒዲቢ (GFP 2B3Q፣ PNP 4RJ2) ነው።
Rising, A. and Johansson, J. ስፒንሊንግ አርቲፊሻል ሸረሪት ሐር።ብሔራዊ ኬሚካል.ባዮሎጂ.11, 309-315 (2015).
Babb, PL እና ሌሎች.ኔፊላ ክላቪፕስ ጂኖም የሸረሪት ሐር ጂኖች ልዩነት እና ውስብስብ አገላለጻቸውን ያጎላል።ብሄራዊ ገነት.49፣ 895–903 (2017)።